产后牛子宫内菌群变化规律及致病性研究(2)

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 采集分别于分娩后第1天（分娩当天记为0 d）、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天进行子宫内容物采集。用0.1%高锰酸钾溶液对奶牛外阴部清洗消毒后，将连接有5 mL注射器的灭菌输精管插入其子宫腔中，回抽子宫内容物。将约2 mL子宫内容物置于事先称重并灭菌的50 mL三角瓶内，再次称重后加入少量灭菌生理盐水，密封后置于含有冰块的采样箱内，3 h内带回实验室进行分离培养及相关检测。

　　1.2.2 细菌计数通过采样前后三角瓶的质量差，计算出所采集到的子宫内容物质量，然后在三角瓶中加入20 mL灭菌生理盐水，充分摇匀后，继续用灭菌生理盐水定容至50 mL。取出1 mL定容后的液体，以10倍稀释法依次稀释样品6次，每次稀释完后从稀释液中取出0.1 mL放入灭菌的平皿内，立即倒入15 mL 45 ℃左右的1.5%营养琼脂，晃动平皿使其混合均匀，待凝固后置于37 ℃培养箱内培养24 h，选择菌落数在30～300之间的平皿进行计数，每个样品重复3次，取其平均值。细菌计数时排除有明显子宫内膜炎症状的样品。

　　1.2.3 细菌的分离纯化与鉴定取1 mL定容后的菌液接入肉汤A培养基，37 ℃恒温培养18～24 h后，期刊网分别划线接种于血液琼脂培养基、双抗巧克力琼脂培养基、改良沙氏琼脂培养基和厌氧琼脂中继续培养。挑取生长状态不同的单个菌落，革兰氏染色、镜检，根据细菌的染色特性并结合菌落形态和生长特性进行初步判断和分类，然后分别接种到相应的培养基上进行纯化。挑取纯化后的单个菌落采用全自动微生物鉴定及分析系统进行细菌的生化鉴定。

　　1.2.4 致病性试验将40只昆白系小鼠随机均分成10组。第10组为对照组，其余各组腹腔内分别注射1 mL各种纯化后的细菌悬液（菌液浓度均调整为1.2×108 CFU/mL）。攻毒后注意观察小鼠的精神状态、饮食和死亡情况，及时剖解死亡小鼠，选取心、肝、脾等脏器进行细菌分离鉴定，检验是否与攻毒菌株相一致。

　　1.2.5 药敏试验将待试菌株制成悬液，用灭菌生理盐水调整比浊度，使其达到0.5麦氏单位，然后用MH肉汤按体积比1∶1 000稀释备用。用菌液将药物按两倍稀释法进行稀释，使每行各孔的药物浓度依次为128、64、32…0 μg/mL，然后将96孔塑料板置于各菌株最佳培养环境下培养18～24 h。以无细菌生长孔内所含抗菌药物的浓度为最低抑菌浓度（MIC）。每株细菌重复测定2次，结果取其平均值。

　　1.2.6 药敏试验结果判定各菌种对不同药物的耐药、中敏、敏感临界值按照美国临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐的数值标准进行判定[4]。药敏试验中未列入CLSI推荐范围的部分抗菌药物，其结果判断参考同类药物标准。

　　2 结果与分析

　　2.1 产后牛子宫内细菌数量的变化

　　牛子宫内细菌计数结果见表1。从表1可以看出，正常分娩后1 d牛子宫内即呈现污染状态，到产后第8天其子宫内细菌数量迅速增加，达到最大值（1.88±0.65）×107个/g，随后细菌数量开始减少，产后第22天平均为（5.66±1.09）×104个/g，产后第29天平均为（2.58±0.47）×103个/g，从产后第29天到产后第43天牛子宫内细菌数量处于缓慢减少的状态。产后第36天有6头牛未检测到细菌存在，产后第43天有5头牛检测到细菌。产后第29天和第36天分别有2头和1头牛出现明显子宫内膜炎症状。

　　2.2 产后牛子宫内细菌种类的变化

　　本试验中，共分离出蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）等9种（311株）细菌。产后第1天共分离出70株细菌，产后第8天分离出的细菌株数最多，为79株，随后分离出的细菌株数逐渐减少，第15天分离出63株，第22天分离出42株，第29天分离出30株，第36天分离出16株，第43天分离出11株。从分离出的细菌种类来看，产后第1天到第29天均为9种，第36天产吲哚金黄杆菌未分离到，第43天产吲哚金黄杆菌、乳房链球菌（Streptococcus uberis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）4种细菌未分离到。分离出的藤黄微球菌（Micrococcus luteus）在各阶段均有较高比例，最高达到了36.36%，其次是大肠埃希菌（Escherichia coli）、浅黄金色单胞菌（Chrysemonas luteola）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），表皮葡萄球菌（Staphylococcus）在产后第1天仅分离出5株，在其后的几个阶段该菌所占比例不断增加，在产后第43天达到了27.27%。

　　2.3 攻毒小鼠临床症状及致病性试验结果

　　小鼠攻毒后4～12 h，均出现精神萎靡，食欲废绝，浑身发抖等临床症状，攻毒8 h后，开始出现小鼠死亡。大肠埃希菌组最先出现死亡病例，随后小鼠死亡集中出现在攻毒后24～48 h，具体结果见表3。由表3可知，大肠埃希菌组小鼠在腹腔攻毒后24 h内全部死亡，蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌、表皮葡萄球菌组小鼠在腹腔攻毒后2 d内全部死亡，其余攻毒组在攻毒后3 d内出现部分小鼠死亡。对死亡小鼠解剖后进行细菌重分离，除浅黄金色单胞菌组外，其余各组均从病变脏器中回收到所接种的细菌。未死亡小鼠大部分在攻毒48 h后症状开始逐渐减轻，攻毒72 h后未死亡小鼠大部分恢复正常。对恢复正常的小鼠进行病原重分离，除棒状杆菌属外均未分离到接种菌；对未完全康复的小鼠进行病原重分离，除攻毒屎肠球菌组外其余均分离到接种菌。对死亡小鼠进行解剖，发现攻毒大肠埃希菌组小鼠病变最严重，均出现急性败血症，腹部胀气，剖检后可见小肠出现坏死，肠管胀气并有大量黄色液体，脾脏和肝脏淤血并出现坏死，母鼠子宫也出现水肿、淤血等；攻毒其他菌种死亡小鼠腹腔内有液体渗出，脾脏和肝脏出现部分坏死和出血点。

　　2.4 药敏试验结果

　　选择对小鼠致病性较强的大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌、表皮葡萄球菌、产吲哚金黄杆菌进行药敏试验，结果见表4。由表4可以看出，5种细菌均对阿莫西林和氨苄西林耐药，对环丙沙星、恩诺沙星、强力霉素、氯霉素、头孢他啶敏感。此外，蜡样芽孢杆菌还对庆大霉素、安普霉素、粘菌素和链霉素表现为耐药；表皮葡萄球菌对粘菌素、青霉素、磺胺氯吡嗪钠和林可霉素耐药；大肠埃希菌对青霉素、林可霉素耐药；藤黄微球菌对安普霉素、粘菌素、链霉素、磺胺氯吡嗪钠和林可霉素耐药；产吲哚金黄杆菌对青霉素耐药。因此，在防治牛子宫内膜炎时应尽量避免使用阿莫西林、氨苄西林、青霉素等药物，可选择环丙沙星、恩诺沙星等敏感药物。

　　3 小结与讨论

　　牛产后由于其子宫颈和阴道的开张，外界和阴道内的微生物容易进入子宫腔内，产后初期子宫腔及阴道内的组织碎片和分泌物为微生物的繁殖提供营养，同时产后初期牛免疫力及子宫自净能力低下，容易导致微生物的大量繁殖。张维军等[5]的研究表明，奶牛产后第2天子宫内呈现污染状态，产后第8天子宫内细菌计数达到最高，随后开始缓慢下降；王国卿[6]研究认为产后第7天牛子宫内细菌数量最多，此后由于恶露减少，子宫防御能力加强，子宫内细菌数量逐渐减少，产后第39天子宫内细菌数量不可计。该结论与本试验结果相似。在机体健康时，大多数牛能凭借自身的防御系统，通过子宫的自净功能排除病原微生物，在一定时期内使子宫达到无菌状态。刘春杰[7]认为健康牛在产后21 d内通过子宫的自净功能将子宫内微生物排出体外，子宫开始呈现无菌状态，产后46～60 d子宫的感染率会下降到9%以下。本试验结果表明，产后第36天牛子宫内逐渐呈现无菌状态，产后第43天牛子宫感染率下降为26.31%。造成结果差异的原因可能与本试验采样牛场的饲养管理与饲料营养水平有关，本试验采样牛场饲养管理相对粗放，饲料营养水平低，因而造成环境微生物菌群复杂，机体免疫力低下。

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