当前位置: > 论文中心 > 医学论文 >

RNAi体外沉默淋巴管内皮祖细胞VEGFR—3基因表达

时间:2014-10-22 17:07 点击:
[摘要] 目的 应用聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)包裹淋巴管内皮祖细胞(lymphatic endothelial progenitor cells,LEPCs)血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)基因siRNA,体外沉默VEGFR-3基因表达,研
  [摘要] 目的 应用聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)包裹淋巴管内皮祖细胞(lymphatic endothelial progenitor cells,LEPCs)血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)基因siRNA,体外沉默VEGFR-3基因表达,研究抑制LEPCs分化抗肿瘤淋巴管新生的作用。 方法 Ficoll法分离人脐血单个核细胞,流式细胞仪、免疫荧光分选并鉴定LEPCs。PEI包裹VEGFR-3siRNA并转染入LEPCs,流式细胞仪检测转染效率。RT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白质水平VEGFR-3基因沉默效果。 结果 VEGFR-3siRNA成功转入LEPCs,转染效率30%。VEGFR-3siRNA转染组LEPCs VEGFR-3mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05)。 结论 体外经由PEI介导的siRNA能有效的抑制LEPCs VEGFR-3的表达,为以LEPCs为靶点抑制肿瘤淋巴管新生提供了实验依据。

  [关键词] 淋巴管内皮祖细胞;VEGFR-3;聚乙烯亚胺;siRNA;淋巴管新生

  [中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616(2014)18-11-04

  肿瘤淋巴管的新生与肿瘤转移有密切的联系,能否有效抑制肿瘤淋巴管新生成为肿瘤治疗的研究热点。2005年,Wang等[1]继Salven[2]之后提出了CD34+/CD133+/VEGFR-3+细胞为LEPCs。在趋化因子的作用下,LEPCs动员、迁移至病变组织,血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor,VEGF-C)通过VEGF-C/VEGFR-3信号途径诱导其向淋巴管内皮细胞分化,进而促使新的淋

  巴管生成[3-4]。Religa等[5]对淋巴管炎症角膜小鼠进行辐射处理后输入骨髓源性的细胞,发现VEGFR-3+细胞出现在新生淋巴管中;Bogos等[6]检测到小细胞肺癌患者血中CD34与VEGFR-3双阳性细胞明显增多,且与癌细胞淋巴结转移呈正相关。上述结果提示,VEGFR-3在LEPCs参与的肿瘤淋巴管的新生中起重要作用[7],如果我们靶向阻断VEGFR-3来抑制VEGF-C/VEGFR-3信号途径参与的肿瘤淋巴管新生,可达到抗肿瘤淋巴转移的目的。

  RNAi是将与靶基因的mRNA同源互补的dsRNA导入细胞,特异性地降解靶基因的mRNA,毕业论文格式从而产生相应的功能表型缺失的技术。本实验应用RNAi技术,拟将与VEGFR-3同源的siRNA转染入LEPCs,抑制其分化为淋巴管内皮细胞,从而达到抗淋巴管新生的目的,为抗肿瘤淋巴管新生提供实验依据和方法。

  1 材料与方法

  1.1 主要试剂与仪器

  DMEM(Gibco),兔抗人VEGFR-3(Santa cruz),小鼠抗人CD133、CD34(Diagnostica),胎牛血清(四季青,杭州天杭生物科技有限公司),羊抗兔IgG FITC(Chemicon),羊抗小鼠IgG PE(Chemicon),羊抗兔IgG TRITC(Jackson),Trizol(Invitrogen),cDNA反转录试剂盒(Fermentas),Ladder DNA、蛋白质marker(Bio-rad),蛋白提取试剂盒(pierce),PEI(25kDa,Sigma Aldrich)。

  流式细胞仪(FACS Calibur,FACSAria,BD);PCR仪(9600型,PE);转膜仪和蛋白电泳仪(Bio-rad);恒温培养箱(Heraeu);Olympus荧光显微镜、相差倒置显微镜(Nikon)。

  1.2 单个核细胞的分离

  取50~60mL足月正常分娩胎儿脐血,加入103 IU肝素。按Ficoll液密度梯度离心法[8]分离单个核细胞。将静置后的上部血液等量稀释后加于Ficoll液面上,Ficoll液与稀释血液的比例约为1∶2,离心(360g,25min)。将含有单个核细胞的液段移至另一离心管,PBS混悬后离心(250g,12min),收集细胞。

  1.3 LEPCs的分选

  用PBS(含1%BSA)清洗细胞,PBS混悬细胞,调整细胞密度1×107个/mL,加兔抗人VEGFR-3(1∶100),4℃孵育55min。用PBS洗3次,加1∶100 TRITC标记的羊抗兔IgG,4℃孵育30min。PBS清洗后,用DMEM(含2.5%FBS)重悬细胞[9],FACS Aria流式细胞仪分选VEGFR-3阳性细胞。将分选出的细胞培养后进行免疫荧光鉴定CD34和CD133的表达[4]。

  1.4 VEGFR-3 siRNA抑制率的检测

  1.4.1 VEGFR-3 siRNA的设计(表1)与合成(上海生工)

  1.4.2 体外转染 (1)siRNA/PEI溶液的制备:将制得的PEI载体溶液(1mg/mL)滴加入siRNA溶液(1μg)中(N/P=8),振荡,室温孵育30min。(2)每

  孔4×104个细胞接种于24孔板至细胞汇合度40%~60%,PBS清洗,加入无血清的DMEM。(3)将siRNA/PEI溶液分别加入细胞中轻轻混匀,转染6h后,更换完全培养基。荧光显微镜观察后消化细胞,流式细胞仪分析转染效率。

  1.4.3 半定量RT-PCR 实验分五组:空白转染组、对照转染组、siRNA a组、siRNA b组、siRNA c组。体外转染同上,各组细胞数1×107,更换完全培养液培养至48h[10]。将Trizol 1mL加入培养皿中,吹打数次,将细胞裂解液转至1.5mL EP管中,室温静置5min;加入氯仿0.2mL,振荡15s,室温放置10min,12 000rpm,4℃离心10min;将上层液体移至另一个1.5mL EP管中,加异丙醇0.5mL,冰上放置10min,12 000rpm,4℃离心10min;弃上清加75%乙醇1mL涡旋振荡,8000rpm,4℃离心5min。弃去上清,干燥沉淀,加入40μL DEPC水溶解RNA。RT的反应条件:30℃10min,45℃ 30min,99℃ 5min,4℃ 5min;PCR反应条件:94℃ 2min,然后94℃ 30s,54℃ 45s,72℃ 1min,30个循环。VEGFR-3引物序列(f)5'TTTGTGGAGGGAAAGAATAAGA3'(r)5'GGACAGGTTGAGGGGCTA3'由上海生工合成,扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。每组分别取3个样本,实验重复3次。

  1.4.4 Western blot 转染步骤同上,转染后培养72h,弃培养基,用0.01M PBS浸洗2次。加入RIPA蛋白提取试剂,冰上裂解25min;用刮勺将细胞刮取至1.5mL EP管中(冰上操作),12 000rpm,4℃离心12min,上清液转移至EP管中,BCA法测蛋白含量。各组上样量相同,SDS-PAGE电泳分离蛋白,将凝胶上的蛋白用湿式电转移到PVDF膜上,用含3%BSA封闭液封闭,然后1mL兔抗人VEGFR-3抗体稀释液(1∶200)处理,以同样的方式加入HRP标记的羊抗兔IgG孵育2h。用ECL法显影。

  1.5 统计学分析

  数据均经SPSS13.0软件进行处理,用()表示;多组间的比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 体外转染结果

  N/P=8时,流式细胞仪检测siRNA/PEI转染组转染效率为30%。

  2.2 各组VEGFR-3 siRNA抑制VEGFR-3表达的分析

  2.2.1 半定量RT-PCR结果分析 各组VEGFR-3mRNA表达结果显示,空白与阴性转染组之间无差异,siRNA a组、siRNA b组、siRNA c组与空白转染组和阴性转染组比较均有显著差异,其中siRNA a组抑制效率最高(图1)。

  Marker 空白 阴性 a b c

  GAPDH(590bp)

   论文榜(www.zglwb.com),是一个专门从事期刊推广、投稿辅导的网站。
本站提供如何投稿辅导,寻求投稿辅导代理,快速投稿辅导,投稿辅导格式指导等解决方案:省级投稿辅导/国家级投稿辅导/核心期刊投稿辅导//职称投稿辅导。


栏目列表
联系方式
推荐内容
 
QQ在线咨询
投稿辅导热线:
189-6119-6312
微信号咨询:
18961196312