浦东新区5岁以下儿童腹泻病病原谱监测分析

　　腹泻病是由多病原多因素引起的一种疾病，可由感染及非感染因素所致，感染性腹泻有细菌感染和病毒感染。随着疾病谱的变迁，在上海地区一些曾经严重危害人群健康的肠道传染病，临床表现越来越不典型，发病率已降低至较低水平；随着分子流行病学的进步以及监测系统的完善，小肠结肠炎耶尔森菌、类志贺邻单胞菌等少见菌亦有检出，故加强对腹泻病的监测工作，追踪病原谱的变迁趋势，为制定防治策略提供依据显得十分必要。为了掌握浦东新区5岁以下儿童腹泻病的主要病原体及流行特征和毒株变化趋势，在我区开展了5岁以下儿童腹泻病病原谱监测，现报道如下。
　　1对象与方法
　　1.1调查对象
　　自2012年2月-2013年1月，在本区设置浦东新区人民医院、儿童医学中心为监测点医院。调查的腹泻儿童需满足：①每日排便3次或3次以上，且大便性状有改变；②年龄在0～59月龄的儿童。同一患者治愈后间隔7天再次腹泻，定义为发生另一次腹泻。
　　1.2调查内容和方法
　　监测点医院发现符合监测病例定义的患者时，采集标本同时填写个案调查表，调查内容主要包括：儿童基本情况，入院情况（发病、就诊日期，症状、大便常规检测结果）、标本采集信息。
　　1.3采样方法
　　采集性状改变的粪便5克/5毫升，置于无菌粪便采样杯（不加任何试剂），用3支无菌棉拭多点采集粪便标本（如有脓血或黏液应挑取脓血、黏液部分，液体粪便应取絮状物，使棉拭表面布满粪便），置于试管内，试管内标本放置在4-8℃冰箱中保存不超过24h，采样杯内标本采集后30分钟内立即将标本放置在-20℃冰箱中。采集标本的时间需覆盖全年各月，每家监测点医院每周采集标本5-8例。
　　标本送至浦东疾控微检科进行肠道致病菌（致泻大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弧菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌）、诺如病毒（NV）、轮状病毒（RV）、肠道腺病毒（EADV）、星状病毒（ASTV）、扎如病毒（SPV）的检测。
　　1.4检测方法和试剂
　　1.4.1病毒检测试剂和方法
　　1.4.1.1主要试剂：检测试剂均采用商品化核酸扩增荧光检测试剂盒，其中，NV、EADV试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，RV、ASTV和SPV试剂盒购自上海之江生物科技有限公司，所有试剂均在有效期内使用。
　　1.4.1.2实验方法：粪便标本处理：取2g左右粪便加入装有10ml磷酸缓冲液的15ml离心管中，拧紧离心管，用震荡器剧烈震荡，用冷冻离心机离心3000g×10min，取200μl上清液用QIAxtractor全自动核酸抽提仪提取核酸，得到总核酸体积为60μl，备用。
　　1.4.1.3.实时荧光定量-聚合酶链反应（real-timequantitativePCR，RQ-PCR）：检测根据商品化的RV、NV、ASTV、SPV、EADV实时荧光试剂盒说明书，将提取好的核酸标本在OPTICON2实时荧光定量PCR仪、7500fast实时荧光定量PCR仪以及7000实时荧光定量PCR仪上进行RQ-PCR反应。试剂配制及荧光PCR反应条件参见试剂盒说明书。
　　1.4.2细菌检测试剂和方法
　　1.4.2.1主要试剂碱性蛋白胨水增菌液、改良磷酸盐缓冲液增菌液、麦康凯培养基、TCBS培养基由上海市疾病预防控制中心腹泻病试剂供应中心提供；沙门菌SBG增菌液、沙门菌显色平板由科玛嘉科技股份有限公司提供；XLD培养基、气单胞培养基、CIN培养基干粉试剂由英国OXOID公司提供。
　　1.4.2.2试验方法肠道病原细菌检测方法参照中国疾病预防控制中心腹泻症候群监测技术方案，大肠杆菌、志贺菌采用直接接种培养基；致泻性弧菌（霍乱弧菌、副溶血性弧菌）、沙门菌、气单胞菌、类志贺邻单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌采样增菌后，接种相应的培养基，在适宜的培养温度下，培养18-24小时后挑取可疑菌落进行进一步的生化鉴定分析。
　　1.5资料收集及统计方法
　　运用Epidata3.0建立数据库，数据进行双录入。用SPSS16.0软件进行数据分析，卡方检验对多个标本率进行比较。
　　2结果
　　2.1基本情况
　　2012年2月-2013年1月共监测5岁以下腹泻儿童619例，监测病例年龄最小出生不足一月的婴儿，最大年龄为4岁。分析不同年龄组病例之间的性别构成，无统计学差异（=1.3698，P=0.8494），性别分布各组均衡（表1）。
　　表15岁以下腹泻儿童年龄性别构成
　　2.2症状
　　监测病例中，就诊前出现腹泻天数最长达60天，腹泻1天后就诊人数为最多，有369人（占59.61%），当天就诊有82人（占13.24%），间隔2天后就诊83人（占13.41%），其余为腹泻3天后就诊，有85人（占13.73%）；平均每天腹泻次数3-5次有498人，占80.45%，6-10次有112人（占18.09%），10次及以上有9人（占1.45）；病例中171人（27.58%）有呕吐症状；207人（33.39%）有发热症状；仅3人（0.48%）有脱水症状；30人（4.85%）采样前一周使用过抗生素。
　　2.3检出结果
　　2.3.1感染状况：
　　619例监测病例中，共检出病原216株，阳性检出率为34.89%，其中检出病毒152株，阳性检出率为24.56%，检出细菌64株，阳性检出率为10.34%；混合感染30例，共检出阳性病原60株，其中两种病毒感染15例，占混合感染的50%；其中两种细菌感染5例，占混合感染的16.67%；病毒和细菌混合感染10例，占混合感染的33.33%（表2）。
　　检出细菌中，致泻性大肠埃希菌的阳性检出率为最高，为5.65%，其余由高到低排序分别为：非伤寒沙门菌（2.42%）、弯曲菌（0.81%）、嗜水气单胞菌（0.65%）、志贺菌（0.48%）、小肠结肠炎耶尔森菌（0.32%）。
　　检出病毒中，NV的阳性检出率为最高，为11.95%，其余由高到低排序分别为：RV（7.27%）、EADV（2.91%）、SPV（1.45%）、ASTV（0.97%）。
　　表25岁以下腹泻儿童病原检出情况
　　2.3.2分型结果检出轮状病毒45株，其中A组44株（97.78%），C组1株（2.22%）；检出诺如病毒74株，其中GII型73株（98.65%），GI型1株（1.35%）；检出致泻性大肠埃希菌35株，其中肠道致病性大肠埃希菌（EPEC）22株（62.86%）、肠粘附性大肠埃希菌（EAEC）7株（20.00%）、产肠毒性大肠埃希菌（ETEC）6株（17.14%）。
　　2.3.3性别分布
　　619例监测病例中，分析不同性别组之间的细菌检出率和病毒检出率，差异无统计学意义（细菌=1.429，P=0.232，病毒=0.08，P=0.777）。
　　表35岁以下腹泻不同性别儿童病例数及检出病例分布
　　2.3.4年龄分布
　　619例监测病例中，分析不同年龄组病例之间的细菌检出率和病毒检出率，差异无统计学意义（细菌=1.667，p=0.797，病毒=5.724，p=0.221）。
　　表45岁以下腹泻儿童各年龄组病例数及检出株数分布
　　2.3.5时间分布
　　细菌的检出率4月份至10月份为15.34%（56/365），远高于其他月份的3.15%（8/254），=31.22，P<0.050；病毒的检出率8月份至来年的3月份为27.70%（113/408），高于其他月份的18.48%（39/211），=7.18，P<0.050。
　　表55岁以下腹泻儿童各月病例数及检出株数分布
　　3、讨论
　　感染性腹泻为一组广泛存在并高发的肠道传染病，也是重要的公共卫生问题之一。在619例监测病例中阳性菌株检出率10.34%，致泻性大肠埃希菌是主要病原，检出率为5.65%，与目前我国各地区细菌性腹泻病原报道有所不同，如2010年浙江850例阳性率39.65%，以变形杆菌为主[1]；2010年深圳龙岗区1027例24.15%，以大肠埃希菌为主[2]；贵阳2010年434例11.06%，以沙门菌为主[3]。考虑不同地区之间因气候环境，生活方式，饮食习惯，经济发展和公共卫生管理等不同，导致感染性腹泻病原菌的检出率和分布也不尽不同。
　　一般国内的病毒性腹泻中RV是最主要的病原[4，5，6，]，而本次研究病毒检出率从高到低顺序是NV、RV、EADV、SPV、ASTV，RV位列第二位，阳性率为7.27%，这可能与浦东新区逐年提高的轮状疫苗接种率有关，2012年浦东新区小于1岁儿童的轮状疫苗接种率达到52.28%，提示随着接种率的提高，轮状病毒腹泻得到较好的控制。现有腹泻病防制策略，更多关注夏季以霍乱为首的细菌性腹泻，秋冬季儿童病毒性腹泻尚未得到足够重视[7]，鉴于疫苗是预防病毒性腹泻的最有效措施，可否考虑将轮状病毒疫苗纳入计划免疫一类疫苗接种程序，以此更好的预防控制5岁以下儿童病毒性腹泻。
　　本次监测中，细菌的检出率4月份至10月份为15.34%，远高于其他月份的3.15%，发病高峰期与国内报道多以7-9月为高峰期略有不同[8，9]，这与上海的高温持续时间完全吻合，上海自4月份气温开始升高，5月份入夏，高温持续至10月份，提示细菌性腹泻以夏秋季防控为重点；病毒的检出率8月份至来年的3月份为27.70%，高于其他月份的18.48%，检出情况符合温带国家"秋冬季高发，夏季最低"的流行特征[10]，但有向春季蔓延的趋势。病毒全年的检出率在17.65%-34.43%之间，儿童发病呈现全年较高的趋势，提示儿童病毒性腹泻防控应着眼于全年，尤以秋冬季防控为重点。
　　分析不同性别组之间的细菌检出率和病毒检出率，差异无统计学意义，提示应将5岁以下各年龄组儿童均作为疫情防控的重点人群。但各年龄组病毒的检出率均明显高于细菌的检出率，这与当前诸多研究公认的病毒才是婴幼儿及儿童感染性腹泻的主要病原是相一致的，如岳阳刘梅芳等[11]对岳阳市5岁以下儿童病毒性腹泻病原学分析显示：腹泻是引起全世界5岁以下儿童发病和死亡的主要原因之一，而病毒是导致腹泻的主要病原。
　　本次监测中以往少见菌种如小肠结肠炎耶尔森菌、类志贺邻单胞菌等此次亦有检出，显示随着分子流行病学的进步，检测技术的提高，一些少见菌种可被检出。
　　本次监测中混合感染30例，共检出阳性病原60株，阳性检出率为9.69%，占总阳性检出的27.91%，以NV合并其他感染为主，共计16株，其中NV合并感染其他病毒10株，合并感染细菌6株；RV合并其他感染共计9株，其中RV合并感染其他病毒7株，合并感染细菌2株；致泻性大肠埃希菌合并其他感染12株，其中致泻性大肠埃希菌合并感染其他细菌4株，合并感染病毒8株。混合感染是一个不容忽视的问题，易引起婴幼儿重症腹泻，需加强研究，值得关注。
　　本研究的优点和局限性：优点在于本次监测纳入的病例均经过了病毒和细菌实验室检测确诊，细菌和病毒的病原特征和季节分布等还是存在一定的差异。缺点是未进行寄生虫病检测。总之，本监测提示：完善腹泻病的监测网络，及时掌握本区腹泻的流行特征与优势病原体，了解其变化规律，为制定有效的预防控制措施提供依据，是感染性腹泻的预防和控制的关键。
　　感谢浦东新区人民医院和儿童医学中心在标本提供方面给予的大力支持；感谢单位微检科同志及时完成对标本的检测工作。
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