Colo205来源大肠癌始动细胞分转移相关基因的表达分析(2)

　　1.2.2体外分化及裸鼠成瘤试验

　　将分选所得CD133+与CD133-细胞密度调整至105/ml接种SFM培养，每2-3天加入2ml SFM培养基。10d天后向SFM中加入胎牛血清（SFM与胎牛血清的体积比为9：1），继续培养。将分选得到CD133+、CD133-细胞及未分选的colo205细胞分别用生理盐水稀释，以1×103、1×104、1×105细胞数量分别将CD133+、CD133-细胞及未分选的colo205细胞接种至同一只babl/ c裸鼠左右腋下和右侧腹股沟后饲养于SPF级动物房，观察肿瘤生长情况并拍照。

　　1.2.3 RNA-seq及生物学信息学分析

　　用TRIzol?总RNA提取试剂盒提取5g以上的总RNA（OD260/OD280≈1.9～2.0），发表文章利用Dynabeads? mRNA试剂盒利用磁珠法分离纯化mRNA后样品委托上海美吉生物技术公司进行高通量测序文库的构建及数据处理。CD133+组/Colo205组/CD133-等3组样品间两两样品的转录本的表达量变化差异显著，以P<0.05和q<0.05和表达变化差异为-2和2倍为差异表达基因筛选标准。

　　1.2.4 差异基因定量PCR验证为了进一步验证表达谱测序获得基因表达变化数据的可靠性，我们随机选取了p53和BCL11A基因，并以?-actin基因作为内参，进行表达变化的定量PCR验证。P53F，5-′ CCCTCCTCAGCATCTTATCCG-3′; P53R， 5-′CAACCT CAGGCGGCTCATAG-3′;BCL11AF 5-′GACAGGGTGCTGCGGT TGA -3′，BCL11AR 5-′ GGCTTGCTACCTGGCTGGAA -3′;?-actin 引物：?-actin F 5-′ TGGCACCCAGCCAATGAA-3′， ?-actin R 5-′ CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。定量PCR反应条件为：95℃ 预变性2mim，40个热循环扩增（95℃变性 10s ， 60℃ 退火扩增 20s），获得Ct值，以2-△△Ct法进行表达变化分析。

　　2. 结果与分析

　　2.1 大肠癌始动细胞体外分化及成瘤能力大肠癌Colo205细胞SFM培养基培养1d内可见大部分细胞贴壁，随传代次数增多，细胞团趋于球型。CD133+细胞培养1d后，细胞成团并悬浮生长，4d可见典型肿瘤细胞球出现，加入胎牛血清， CDl33+细胞形态与之前在SSM培养基中的Colo205 细胞相同（图1. D），CDl33-细胞则始终未见肿瘤细胞球生成。

　　不同细胞群细胞接种裸鼠，S第15天见105个CD133+细胞接种处开始见肿瘤生长，瘤体迅速增大;第20天104个CD133+细胞接种处见肿瘤生长;接种第30天103个CD133+细胞接种处见肿瘤生长;接种第35天105个colo205细胞接种处见肿瘤生长;第40天104个和103个colo205细胞及CD133-细胞接种处未见肿瘤生长。到42天观察期结束，仅需接种103个CD133+细胞就可以在裸鼠皮下形成肿瘤，所有CD133+细胞接种处均成瘤;而colo205细胞需接种105个才能在第35天形成肿瘤，共有2只裸鼠成瘤;所有CD133-细胞接种处均未见肿瘤生长（图2）。CD133+细胞内成瘤能力强于CD133-细胞及colo205细胞，有明显差异，P<0.05;而CD133-及colo205细胞间成瘤能力无明显差异。

　　2.2 大肠癌Colo205来源细胞群转移相关基因表达变化

　　依据所有样本与参考基因组比对的结果，以FDR<0.05为显著差异基因/转录本筛选条件，利用分析软件Tophat及Cuffdiff分别转录本测序常规数据分析结果表明本次测序所有样品的FPKM分布差异不显著。

　　将Illumina平台测得CD133+、CD133-与未分选细胞基因序列与人参考基因对比后分别得到12915738、16118258及19304605条序列。依据这些序列计算每个基因在三种细胞中的FPKM值，以该值作为基因在该细胞中的表达量，3种细胞癌症转移相关基因的表达进行差异显著性分析发现：CD133+细胞与未分选的colo205细胞相比，有9个基因表达明显上调，3个基因表达明显下调，2个基因表达变化不大;CD133-细胞与未分选的colo205细胞比较的有10个基因表达明显上调，4个基因表达明显下调。CD133+细胞较CD133-细胞差异表达基因中有2个基因表达明显上调，个基因表达明显下调，10个基因表达变化不大。

　　3. 讨论

　　磁珠分选肿瘤干细胞最重要的是确定肿瘤干细胞的表面标志物，目前运用于大肠癌干细胞的标志物有CDl33、CDl66[16]、CD44[17]等。其中CDl33最具有争议性。比如O’Brien [5]等研究显示：在大肠癌细胞中成瘤的细胞均为CD133+，但不是所有的CD133+细胞都可能导致肿瘤的生成，由此认为不是所有的CD133+细胞都是大肠癌干细胞。虽然目前对CD133做为大肠癌的表面标志物，必须结合细胞亚群做成瘤性鉴定[5-11]，如成瘤能力强的细胞亚群能够能在无血清培养基中成球生长并增殖，且形成的肿瘤细胞球能在血清诱导下则贴壁分化，并能在在裸鼠体内形成肿瘤[12-17]。

　　为了筛选与大肠癌诊断密切且相关的基因，本研究对裸鼠成立验证的磁珠筛选的colo205来源的不同细胞群进行表达谱测序分析，并利用定量PCR技术对随机选取的两个锌指蛋白表达进行验证，结果这两个基因的表达变化趋势与表达谱测序结果一致（如基因p53 在CD133+/ CDl33-分别为2.366和1.61，在colo205/ CDl33-分别为2.17和1.6;基因BCL11A在CD133+/ CDl33-分别为2.951067和2.25012，在CD133+/colo205分别为0.149702和0.25174）。

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