2.3金银花药材指纹图谱测定方法

　　2.3.1参照物溶液的制备 金银花中主要有效成分为绿原酸，在金银花药材指纹图谱中，绿原酸峰面积百分比贡献最大，且检测数据稳定，所以选择绿原酸作为参照物。

　　2.3.2供试品溶液的制备 通过提取溶媒考察结果，为了更全面控制金银花药材质量，选择50%甲醇作为提取溶剂，超声30 min提取的提取方法，该方法经过验证，能够较完全地提取金银花中主要成分。方法为：取金银花药材粉末（过4号筛）0.2 g，置50 mL锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定，超声（250 W，35 kHz）提取30 min，放冷，再称定，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

　　2.3.3检测方法 Agilent 1100 液相色谱；MWD多波长紫外-可见检测器，G1313A 全自动进样器，Agilent LC色谱工作站。Phenomenex luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱0～50 min，20%～60%甲醇；50～60 min，60%甲醇。检测波长225 nm；柱温30 ℃；流速1 mL·min-1。

　　2.3.4测定波长 根据供试品溶液紫外光谱，共选择在270，225，245，300，327 nm等5个波长下检测，其中，绿原酸最大吸收波长327 nm，但在该波长下，其他指纹峰都较小，经过对比分析，在225 nm波长的色谱图中各指纹峰峰面积比较平均，绿原酸峰面积适当，且较稳定，故选定检测波长225 nm。延长测试时间1倍至2 h，未见滞后峰出现。

　　2.3.5稳定性试验 取同一批金银花药材供试品溶液，隔3 h测1次，共测6次，计算相似度均不小于0.98，表明供试品溶液15 h内成分是稳定的，符合指纹图谱的技术要求（不小于0.95）。

　　2.3.6精密度试验 同一批金银花药材供试品溶液连续进样6次进行测定。各共有峰的保留时间及主要峰（占总峰面积3%以上）的峰面积基本一致（RSD<3.0%），再以第1次进样所得指纹图谱作为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度均不小于0.99，均符合指纹图谱的技术要求。

　　2.3.7金银花药材标准指纹图谱的确定 采购道地产地山东平邑金银花药材10批、河南封丘金银花药材10批、江苏东海7批（经过鉴定为忍冬科植物忍冬L. japonica的干燥花蕾），共27批样品用于构建金银花药材标准指纹图谱。根据《中药指纹图谱研究的技术要求》，采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价软件，将27批次金银花图谱数据导入《中药指纹图谱相似度计算软件B 版》，匹配后图谱见图3。

　　2.4金银花中绿原酸、木犀草苷含量测定及液相指纹图谱相似度结果分析

　　按2.2，2.3项下绿原酸、木犀草苷含量及液相指纹图谱检测方法对27个批次样品进行测定。绿原酸、木犀草苷含量以干燥品计算，结果见表1。

　　5种加工方法所得金银花药材液相指纹图谱见图5。把每种加工方法得到27批样品分别进行测定，将27批次金银花图谱数据导入《中药指纹图谱相似度计算软件B 版》，获得 “共有模式指纹图谱”作为该种加工方法的标准指纹图谱，分别命名为S1，S2，S3，S4，S5；再与2.3.7项形成的金银花标准指纹图谱进行相似度计算，结果见表1。

　　2.5样品性状

　　5种样品性状有明显不同，自然晒干样品色黄白，花体呈自然弯曲状，蓬松；烘房烘干样品色黄白略带青色，花体呈不自然弯曲，扁瘦；微波杀青与滚筒杀青样品色青绿美观，花体较直，见图6。

　　3讨论

　　为了保证热毒宁注射液中金银花药材质量可控，江苏康缘药业股份有限公司建立金银花药材基地。江苏省连云港市东海县海拔27 m，地属黄淮海平原东南边缘的平原岗岭地，气候属暖温带湿润季风气候，日照充足，雨热同季，四季分明，全年无霜期达225 d，年平均日照2 394 h，年平均降水913 mm，且东海县位于江苏省北部，邻接山东省临沂市，距离金银花道地产区平邑县190 km，根据《中药资源学》记载，属于道地产区划分范围内，而且中国医学科学院药用植物研究所的研究表明，基地所在地的生态适宜性与道地产区山东相似度为95%以上，适宜金银花生长。热毒宁注射液新药研究阶段使用的金银花药材为山东的道地药材，故选择江苏省东海县为金银花规范化种植基地。

　　采用微波杀青方法和滚筒杀青方法得到的金银花药材液相指纹图谱与其他方法由较大差异，2种方法的液相指纹图谱与金银花药材标准指纹图谱比较，保留时间为14.826 min的色谱峰（绿原酸）含量比保留时间为16.509 min与17.66 min的色谱峰峰面积明显变小，保留时间25.235 min的色谱峰峰面积明显增高，导致杀青的2种方法液相指纹图谱相似度在0.85以下。针对微波杀青及滚筒杀青上述指纹图谱的变化情况，专门成立项目组对保留时间25.235 min的色谱峰进行分离及鉴定，确定该成分为裂环马钱素，因其结构上含有一个不稳定的醛基，可控性较差，项目组目前正在对裂环马钱素的药理活性进行深入研究。

　　由于金银花加工过程受热程度及干燥时间不同，绿原酸含量、液相指纹图谱、药材性状有明显差异。传统的自然晒干样品虽然液相指纹图谱相似度大于0.9，但绿原酸及木犀草苷含量最低，且干花色泽较差，同时考虑晒干方法受自然条件影响较大，过程可控性差，不适合大规模种植基地使用。硫磺熏蒸阴干样品绿原酸及木犀草苷含量与烘房烘干法比较接近，但硫磺熏蒸样品指纹图谱在绿原酸峰前有个明显的高峰，其他干燥方法及对照中均未出现，分析原因可能是硫磺熏蒸样品中存有硫残留。2种杀青方法得到的药材绿原酸含量较高，但考虑杀青干燥制备过程中产生了可控性较差的成分，为了保证东海基地金银花药材与热毒宁注射液研究阶段使用药材的一致性，烘房烘干法得到的金银花样品绿原酸、木犀草苷含量、液相指纹图谱相似度均符合要求，故确定为论文范文江苏东海规范法种植基地金银花药材最佳的加工方法。

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