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重组血管紧张素转化酶抑制肽工程菌细胞破碎条件优化(2)

时间:2014-09-10 10:56 点击:
2结果与分析 2.1标准曲线的绘制 标准曲线见图1。以蛋白质浓度(g/mL)为横坐标,以吸光度为纵坐标,得回归方程:y=0.0013x+0.0459,R2=0.997。 2.2酶法与反复冻融法相结合的破

 
  2结果与分析
 
  2.1标准曲线的绘制
 
  标准曲线见图1。以蛋白质浓度(μg/mL)为横坐标,以吸光度为纵坐标,得回归方程:y=0.0013x+0.0459,R2=0.997。
 
  2.2酶法与反复冻融法相结合的破碎条件研究结果
 
  2.2.1冻融次数对菌体破碎率的影响结果见图2。由图2可见,随着冻融次数的增多,菌体破碎率增加,当反复冻融5次时,破碎率已达90%,6次时即达100%。
 
  2.2.2冻融次数对GST-AHP浓度的影响结果见图3和图4。由图3和图4可见,反复冻融6次时,上清液中GST-AHP浓度已达到最大。因此反复冻融的次数确定为6次。此时,上清液中GST-AHP浓度达1.86g/L。
 
  2.3酶法和超声波法相结合的破碎条件研究结果
 
  2.3.1超声时间对菌体破碎率的影响结果见图5。由图5可见,随着超声时间的延长,菌体破碎率增加,当超声时间达到30min时,菌体破碎率达到100%。
 
  2.3.2超声时间对GST-AHP浓度的影响结果见图6和图7。由图6和图7可见,超声时间达30min时,上清液中GST-AHP浓度达到最大(1.83g/L),超声时间进一步延长,GST-AHP浓度不再增加。因此确定超声破碎时间以30min为宜。
 
  2.4两种方法的破碎效果比较
 
  反复冻融6次或超声波破碎30min,细胞破碎率均可达到100%,此时,上清液中GST-AHP浓度达到最大,分别为1.86和1.83g/L。反复冻融法操作较繁琐,耗时长,需要添加价格昂贵的DNase和RNase降解DNA及RNA以降低破碎液黏度,且每次处理量不能太大;而超声波破碎时间短、效率高,且对细胞破碎所释放的DNA、RNA具有一定剪切作用,破碎同时能有效降低其黏度,综合考虑选择超声波破碎为工程菌细胞破碎条件。
 
  3结论
 
  试验结果表明,重组血管紧张素转化酶抑制肽工程菌E.coliBL21(pGEX-4T-2-AHP)破碎的最优工艺条件为:每克湿菌体重悬于3mL含有2mmol/LEDTA的1×PBS缓冲液中,加溶菌酶至终浓度为20000U/mL,室温放置30min后超声波破碎30min,4℃10000r/min离心10min取上清液。超声波破碎条件:Sonics(VC×600型)超声波破碎仪,Ф13mm螺纹探头和Ф13mm螺纹探头可换尖端,振幅75%,开5s,停5s。此条件下上清液中可溶性GST-AHP浓度达到1.83g/L。
 
  参考文献:
 
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