[摘要]目的研究大鼠心肌缺血、缺血再灌注、无创性缺血预处理以及氯化锂干预后心肌细胞β结合素的阳性表达率及细胞凋亡指数的变化，以探讨β结合素与心肌缺血、缺血再灌注的关系以及可能机制。方法将入选的60只大鼠随机分为假手术对照组（C）、缺血组（I）、缺血再灌注组（IR）、氯化锂药物预处理组（PPC）。以TUNEL方法评估各组大鼠心肌细胞凋亡情况，以免疫组化方法测定各组大鼠心肌细胞中β结合素的表达，并计算各组大鼠的心肌细胞凋亡指数及β结合素。结果与C组比较，I、IR、PPC四组凋亡指数均升高（P<0.05），各组心肌细胞凋亡指数比较的结果为：IR组>I组>PPC组>C组（各组两两比较均P<0.05）；各组心肌细胞β_cat阳性表达率比较的结果为：PPC组>C组>I组>IR组。β_cat阳性表达率与凋亡指数呈负相关，R=-0.90。结论β_cat阳性表达率与凋亡指数呈负相关，提示β_cat可以减少心肌缺血、缺血再灌注引起的细胞凋亡。

　　[关键词]心肌缺血；心肌再灌注损伤；凋亡；β结合素；氯化锂

　　缺血性心脏病（IHD）是由多种病因导致的冠状动脉血流量不足、心肌缺血缺氧，从而引起心肌功能障碍和器质性病变。近年来，在心肌梗死后及时实施血运重建（包括静脉溶栓技术、动脉搭桥术、导管技术等）是治疗心肌梗死的最佳措施，挽救了大量患者的生命，但是血液复流后部分缺血的心肌组织代谢障碍和结构破坏反而更加严重，这种现象被称为心肌再灌注损伤（Myocardial Reperfusion Injury， MRI）[1]。MRI反常的抵消了开通血管的有益作用，甚至带来致死性的损伤。目前的研究应用证明抗氧化剂、钙通道阻滞剂、ACEI等对减少MRI后心肌细胞凋亡，改善心肌梗死后心功能等方面起到了重要作用，但效果并没有达到理想水平，相关药物仍在不断研发中。无机离子锂临床上用来治疗躁狂和抑郁症。Klein和Melton于1996年首次报道了锂离子可选择性抑制糖原合成酶激酶_3β（GSK_3β）[2]，目前锂离子已作为一种非常有用的工具用于对GSK_3β广泛的生物学功能的研究，通过锂的作用来研究抑制GSK_3β后细胞功能的改变[3]，GSK_3β及β结合素（β_catenin，β_cat）均是参与Wnt信号传导通路关键介质[4]。本实验拟通过应用氯化锂抑制GSK_3β对β_cat的磷酸化，使细胞内β_cat含量增加，从而观察β_cat变化含量与MRI的关系。

　　1资料与方法

　　1.1实验动物：由广东医学院实验动物中心提供健康雄性SPF级SD大鼠60只，2月龄，体重（200±20）克。随机分为假手术对照组（C）、缺血组（I）、缺血再灌注组（IR）、氯化锂药物预处理组（PPC），共四组，每组15只。

　　1.2大鼠模型的制备：将大鼠禁食12h后，称重，用乌拉坦腹腔注射麻醉（每100g体重大鼠用量为125mg）大鼠固定于手术台。用银针电极插入大鼠四肢皮下，接上心电图机。心电图定标为2mv，检测肢体二导联。颈部切开皮肤，用玻璃分针钝性分离皮下肌肉，暴露气管，用眼科剪将气管剪成T型开口，与动物呼吸机相连，调节呼吸机参数为：潮气量2～3ml/100g，频率60次/分，吸呼比1∶2。术中注意观察气管插管是否通畅以及肺的膨胀情况。在胸骨左缘约1cm处剪开皮肤，钝性分离肌层，剪断3、4肋骨，用扩胸器撑开肋骨，充分暴露术野。剪开心包，用带5/0线的圆针在肺动脉圆锥和左心耳之间进针。C组只在左前降支埋线1h，不结扎冠状动脉。I组结扎前降支1h。IR组先结扎前降支1h，然后松扎3h。PPC组先颈静脉注射氯化锂（剂量为15mg/kg），然后结扎左前降支1h，再灌注3h。

　　1.3采集标本：模型制备成功后，取心尖缺血最明显部位组织，切取小块的心肌组织，立即置于4%多聚甲醛中固定。24h后，流水冲洗2h，先后以浓度为70%，80%，90%，95%，100%的乙醇脱水，每种浓度酒精的脱水时间均为2h，二甲苯透明30min。浸蜡，包埋。每个标本的心肌组织都行4mm连续切片8张，在载玻片上铺有一薄层多聚赖氨酸，切片贴于载玻片上。60℃烘烤4h，将石蜡切片放4℃下保存待测。

　　1.4实验室检测：转移酶介导的末端标记（TUNEL）技术检测心肌细胞凋亡指数，以免疫组化法检测心肌细胞中β_cat的表达。

　　1.5统计学处理：所有实验数据均应用SPSS 17.0软件包处理，经D检验，显示数据成正态分布，故实验数据用均数±标准差（x-±s）。各组样本均数的两两比较采用完全随机设计的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2实验结果

　　C组有1只大鼠因误剪动脉大出血死亡，I组有2只因结扎冠状动脉后室颤死亡，IR组有2只因再灌注心律失常死亡，1只未发现再灌注退出实验，PPC有1只因颈静脉注射时撕裂颈静脉出血较多死亡。共用实验动物60只，最终获得53只大鼠的完整资料。

　　2.1形态学观察：在高倍显微镜下（20×20）观察经TUNEL技术处理过的心肌组织切片，正常心肌细胞的细胞核呈淡蓝色，凋亡心肌细胞的细胞核被染成深浅不一的棕褐色。假手术对照组大多数细胞核呈蓝色，极少数被染成棕褐色；IR组切片大量细胞核深染；PPC组也可见部分细胞核染成棕褐色，其数量较C组多但较IR组少。

　　在高倍显微镜下（20×20）观察经免疫组化处理过的心肌组织切片，阳性表达β_cat的细胞表现为：心肌闰盘处有与心肌纤维垂直的棕褐色条带，细胞浆被染成棕褐色，少数细胞核被染成棕褐色，细胞核被染成棕褐色细胞为β_cat阳性表达细胞。在PPC组可见大量β_cat阳性表达信号，而其余三组相对较少（见图5～8）。图1C组心肌细胞TUNEL观察（20×20）图2I组心肌细胞TUNEL观察（20×20）图3IR组心肌细胞TUNEL观察（20×20）图4PPC组心肌细胞TUNEL观察（20×20）图5C组大鼠β_cat观察（20×20）图6I组大鼠β_cat观察（20×20）图7IR组大鼠β_cat观察（20×20）图8PPC组大鼠β_cat观察（20×20）

　　2.2各组细胞凋亡指数、β_cat阳性表达率比较：.。各组大鼠心肌细胞凋亡指数C组最低（2.0±0.12），I组明显增加（5.50±1.11），IR组进一步增加（22.21±2.31），为各组最高，PPC组较IR组减少（4.35±1.57），但仍较C组高。与C组比较，I、IR组β_cat的含量均降低（P<0.05），而PPC组明显升高（P<0.05），各组心肌细胞β_cat阳性表达率比较的结果为：PPC组>C组>I组>IR组。

　　3讨论

　　IHD是严重威胁人类健康的心脏病，以往对其研究主要着重于改善血供，减缓缺血区心室重构，进而改善心功能。近年来越来越多的学者开始关注再灌注损伤影响。MRI是影响患者冠状动脉再通后心功能的重要因素。现已证明再灌注损伤可以通过钙超载、氧自由基作用、能量代谢障碍等诱导细胞凋亡，导致再灌注心律失常、心力衰竭，甚至猝死。缺血再灌注心肌细胞凋亡的发生同样受凋亡相关基因的调控，其中Bcl_2基因家族被认为是最重要的细胞凋亡基因，包括Bcl_2、Bax、Bcl_w、Bad等[5]。Bcl_2是第一个被认为有抑制凋亡作用的基因。当Bcl_2高表达时，Bcl_2与Bax结合形成异型二聚体Bcl_2/Bax，抑制凋亡的发生[6]。