一种抗真菌抗生素发酵工艺优化及稳定性研究

　　摘要：镜检观察菌株菌落及细胞形态，用正交试验设计法确定菌株最佳发酵条件。结果表明，该菌株与链霉菌形态类似，革兰氏染色呈阳性，最佳发酵条件为葡萄糖１５ｇ／Ｌ，酵母液４０ｇ／Ｌ，装液量３０ｍL／２５０ｍL，发酵时间７２ｈ。所产抗生素对高温（９５℃）具有较高的稳定性，在酸性和中性环境中比较稳定。

　　关键词：菌株；抗真菌抗生素；发酵工艺

　　现代医学的进步提高了重症病人的生存几率，然而由于这些病人的抵抗力较差，易发生条件致病真菌引起的深部感染［１－４］。本研究从土壤中筛选到一株放线菌ActinormycesＳ１，前期试验证明该菌株的代谢产物能对部分导致深部真菌感染的微生物具有较好的抑制作用。本研究通过试验了解该菌株的基本生长特点，运用正交试验优化其发酵工艺条件，并对该抗生素粗提物的相关性质进行了研究，为后续对该菌株的进一步深入研究打下基础。

　　１材料与方法

　　１．１试验材料

　　１．１．１试验菌株由杭州职业技术学院生物制药研究所提供。

　　１．１．２主要培养基斜面培养基：可溶性淀粉２５ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ１ｇ、蛋白胨１ｇ、琼脂２０ｇ、１０％土豆汁１Ｌ（小块状土豆１００ｇ，１Ｌ水煮沸１ｈ后过滤定容１Ｌ，１２１℃蒸汽灭菌２０ｍｉｎ）；平板培养基（ｇ／Ｌ）：高氏一号培养基［５］；指示菌培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖４０、蛋白胨１０、琼脂２０,ｐＨ５．６,１１５℃蒸汽灭菌２０ｍｉｎ；种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１５、硫酸镁０．５、蛋白胨５、磷酸氢二钾１、硫酸亚铁０．０１、碳酸钙０．４,ｐＨ自然，１２１℃蒸汽灭菌２０ｍｉｎ；原始发酵培养基组成（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１０、酵母粉３０、蛋白胨５、磷酸氢二钾１、氯化钠１、碳酸钙１、接种量为１０％，培养基ｐＨ为６．５，装液量５０ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶。

　　１．２试验方法

　　１．２．１菌株生长过程观察将菌株接种至斜面培养基上，恒温３０℃培养，当菌株生长至２、３、４、５、６ｄ时，观察菌落特征，并用印片染色法［６］观察菌株形态，用Ｍｏｔｉｃ数码显微镜观察，拍摄并记录其生长过程。

　　１．２．２发酵液中抗生素效价测定取１０ｍL发酵液１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，以白色念珠菌为指示菌株，用生物管碟法［７］测定发酵液抗菌活性。

　　１．２．３菌株发酵条件优化在原始发酵培养基的基础上，选择对培养基中的碳源葡萄糖、氮源酵母粉以及摇瓶装液量和发酵培养时间４个因素采用Ｌ９（３４）正交试验进行优化［８］，其中４因素分别为葡萄糖的浓度（ｇ／Ｌ）为５、１０、１５，酵母液的浓度（ｇ／Ｌ）２０、３０、４０，摇瓶装液量（ｍL）３０、４０、５０，发酵培养时间（ｈ）６６、７２、７８。

　　１．２．４抗生素的稳定性研究热稳定性试验。将发酵上清液置于９５℃处理１０、３０、６０、１２０ｍｉｎ后，测定其抗生素效价。不同ｐＨ条件下的稳定性试验。将发酵液上清液分为３份，调节ｐＨ，使之分别处于酸、中、碱性环境中，在９５℃条件下处理１０ｍｉｎ后，测定其抗生素效价。

　　２结果与分析

　　２．１菌株生长过程观察

　　３０℃恒温培养２ｄ后，平皿上出现紫色的小型菌落，表面光滑，周围略微可见稀疏菌丝。镜检观察可见少量气生菌丝，颜色较深，菌丝粗而长，分支较多。培养３ｄ后，菌落紫色渐退，颜色趋灰色，表面干燥丰满，边缘绒状菌丝增多。镜检发现气生菌丝数量明显增多，互相缠绕，部分菌丝前端出现白色透明的孢子丝。培养４ｄ后，医学论文菌落明显增大，颜色为灰色。此时气生菌丝完全交错缠绕成团状，大量菌丝出现白色透明孢子丝，同时可见有少量孢子散落，颜色多呈白色透明。培养５ｄ后，肉眼可见菌落表面多褶皱突起或颗粒，颜色灰色。镜检观察到大量孢子形成，形成串状或散落成颗粒，具深色。培养６ｄ后，孢子散开成单个，或２个甚至多个呈链状排列，孢子形状多为椭圆或圆形，颜色深色，菌丝已经完全消失。由此可知该菌株斜面生长至６ｄ后完全成熟，其菌落和细胞形态上与链霉菌属放线菌相似。革兰氏染色结果显示菌株为阳性菌。

　　２．２菌株发酵培养优化

　　根据Ｌ９（３４）正交表对发酵培养基及培养条件进行试验优化，结果及数据处理见表１。由表１可知，当葡萄糖为１５ｇ／Ｌ，酵母液４０ｇ／Ｌ，装液量３０ｍＬ／２５０ｍＬ，发酵培养时间保持在７２ｈ时，菌株的发酵效价最高。按照该发酵组合进行重复试验３次，发酵液抑菌圈平均直径为２．１８ｃｍ，优化结果符合预期。

　　由ｒ值可知，以上４个因素对发酵效价的影响程度由大到小依次为酵母液浓度、装液量、发酵培养时间、葡萄糖浓度，因此在后续的进一步发酵优化时，可重点考虑对结果影响较大的一些因素。

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