摘要:以大豆为试验材料,研究了干旱胁迫下NO对抗氧化酶活性的调节作用。结果显示,干旱胁迫处理显著地增强了大豆根中NO产生和抗氧化酶SOD、CAT和POD活性;外源NO处理进一步增加了抗氧化酶活性,而NO清除剂处理则抑制了NO产生和抗氧化酶活性;NO合成酶(NOS)抑制剂和硝酸还原酶(NR)抑制剂处理均明显抑制了干旱胁迫下NO产生和抗氧化酶活性,且NOS抑制剂影响程度更大。此外,干旱胁迫增强了NOS和NR活性,而且NOS活性增幅比NR大。这些结果表明,干旱胁迫下NOS和NR途径介导的NO产生参与了大豆根中抗氧化酶活性的调节,而且NOS途径起着主要作用。

 

　　关键词:大豆;干旱胁迫;一氧化氮(NO);抗氧化酶

 

　　中图分类号:S565.1;Q945.78文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)11-2493-04

 

　　Effects of NO on the Activity of Antioxidative Enzymes in Soybean Seedlings

 

　　under Drought Stress

 

　　WANG Hua-hua, YANG Li-dan, HUANG Jun-jun

 

　　(College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China)

 

　　Abstract: Soybean was used to investigate the regulatory role of NO on the activity of antioxidative enzymes in soybean seedlings under drought stress. The results showed that NO production and activities of SOD, CAT and POD were significantly increased in the soybean roots exposed to drought stress. Application of exogenous NO to soybean seedlings further increased the activity of antioxidative enzymes, while NO scavenger inhibited NO production and the activity of antioxidative enzymes. Both inhibitors of NO synthase (NOS) and nitrate reductase (NR) significantly inhibited NO production and the activity of antioxidative enzymes under drought stress, and NOS inhibitor had greater effect than NR inhibitor had.The activities of NOS and NR were increased under drought stress, and NOS activity was more than NR activity. The results indicated that both NOS and NR mediated NO production was involved in regulating the activity of antioxidative enzymes under drought stress. NOS pathway played a dominant role in this process.

 

　　Key words: soybean; drought sress; nitric oxide(NO); antioxidative enzymes

 

　　基金项目:国家自然科学基金项目(U1204305);河南省教育厅科学技术研究重点项目(13A180515);河南省基础与前沿技术研究项目(132300410455)

 

　　干旱是影响世界上许多地区农业生产的最主要环境因子之一。研究表明,全世界由于干旱造成的作物减产超过了其他逆境因子危害的总和[1]。干旱胁迫可以导致活性氧的过量积累,使得细胞内自由基的代谢平衡遭到破坏,引发或加剧膜脂过氧化作用,造成细胞膜系统的损伤。植物在长期的适应过程中,形成了一整套清除活性氧的抗氧化酶防御体系,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等,这些酶已广泛用于植物抗逆境反应机理的研究[2]。目前在小麦[3]、大豆[4]、花生[5]等方面的研究工作均证明抗氧化酶活性与植物抗旱性有着密切的关系。然而,对于干旱胁迫下抗氧化酶活性的调节机制报道很少。

 

　　一氧化氮(NO)是生物体中重要的氧化还原信号分子,在植物体内的酶促途径主要是通过硝酸还原酶(NR)和一氧化氮合成酶(NOS)催化合成[6]。大量的研究表明,NO参与了植物生长发育和环境胁迫响应过程,如种子萌发、根生长、细胞凋亡、防御相关基因的表达以及植物的耐逆反应等[7,8]。近些年来,NO对植物抗逆性调节作用的研究已经受到了广泛的重视。在小麦[3]、刺槐[9]、枳[10]等植物中的证据表明,施用外源NO可缓解干旱胁迫对植物造成的伤害,其原因与NO增强的抗氧化酶活性密切相关。但是,对于干旱胁迫下内源NO是否参与了植物抗氧化酶活性的调节目前还不清楚。

 

　　目前对于干旱胁迫下NO与抗氧化酶关系的研究多集中于外源NO对抗氧化酶系活性的影响,很少探讨干旱胁迫下内源NO对调节抗氧化酶系的作用。本研究以大豆为试验材料,利用NO清除剂、NO产生途径相关抑制剂处理,探讨了干旱胁迫下内源NO在调节抗氧化酶中的作用以及干旱胁迫下NO的产生来源,以期为大豆抗旱机理的研究和选育抗旱品种提供理论依据。

 

　　1材料与方法

 

　　1.1供试材料

 

　　供试大豆(Glycine max)品种为河南省大面积种植的豫豆19(种子由河南省农业科学院提供)。

 

　　1.2材料培养

 

　　挑选大小一致的大豆种子,用5%次氯酸钠消毒15 min后,用自来水反复冲洗干净,放入水中浸泡3 h使种子充分吸胀,然后将种子于恒温箱内25 ℃黑暗条件下萌发2 d。挑选萌发一致的大豆种子,将其种在放有蛭石的托盘里,并用1/4 Hoagland溶液浇灌。培养条件:25 ℃,14 h光周期,相对湿度控制在70%。

 

　　1.3材料处理

 

　　以聚乙二醇(PEG)6000模拟干旱胁迫处理。将生长3 d的幼苗取出洗净后转移到盛有10% PEG、 100 μmol/L 硝普钠(SNP)、200 μmol/L N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)、20 μmol/L叠氮化钠(NaN3)和200 μmol/L 2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(PTIO)溶液的塑料容器中进行不同处理。处理24 h后收集大豆主根用于各项指标的测定。

 

　　1.4测定方法

 

　　相对电导率采用DDS-307A型电导率仪测定,参照Wang等[11]的方法;丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法[11];超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光氧化还原法[12],SOD活性以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位;过氧化氢酶(CAT)活性测定参照Wang等[12]的方法,CAT活性以消耗1 μmol(H2O2)/min为一个酶活性单位;过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法[12],以每分钟A470 nm变化0.01为1个酶活性单位。NO含量通过氧合血红蛋白向高铁血红蛋白转化的量来计算,参照Murphy等[13]的方法;NOS和NR活性测定参照Tian等[14]的方法。所测指标均选用大豆的主根为试验材料,3次重复,取平均值。

 

　　2结果与分析

 

　　2.1干旱胁迫对大豆幼苗相对电导率和MDA含量的影响

 

　　相对电导率和MDA含量是反映植物细胞遭受伤害程度的常用指标。由图1可知,5% PEG处理大豆1 d,根中相对电导率和MDA含量略微增加;随着PEG用量的增加,相对电导率和MDA含量表现出显著增加的趋势。从形态上看,15% PEG处理时,植株表现出明显的萎蔫现象;20%PEG处理时则表现出非常严重的萎蔫。表明轻度胁迫(5% PEG)对大豆相对电导率和MDA含量影响较小,重度胁迫(>15% PEG)对其影响则较大。根据以上试验结果,后续试验选定中等胁迫程度(10% PEG)进行干旱胁迫处理。

 

　　2.2干旱胁迫下NO对大豆幼苗抗氧化酶活性的影响

 

　　如表1所示,PEG处理显著增加了大豆根中SOD、CAT和POD的活性,比对照分别增加了59.7%、91.5%和75.9%。SNP(NO供体)处理则进一步增加了干旱胁迫下大豆根中SOD、CAT和POD活性,分别比PEG处理增加了15.2%、27.9%和33.3%。结果表明,外源NO可增加干旱胁迫诱导的抗氧化酶活性。PTIO(NO清除剂)处理则抑制了干旱胁迫诱导的抗氧化酶活性,表现出与对照相近的水平,表明内源NO参与了干旱胁迫诱导的抗氧化酶活性的调节。L-NNA(NOS抑制剂)处理显著地抑制了干旱胁迫下大豆根中SOD、CAT和POD活性;NaN3(NR抑制剂)处理也抑制了干旱胁迫下大豆根中SOD、CAT和POD活性。这些结果表明,NOS和NR介导的NO产生途径均参与了干旱胁迫下抗氧化酶活性的调节,并且NOS途径起着主导作用。

 

　　2.3干旱胁迫对大豆幼苗NO产生的影响

 

　　为了进一步证实NO参与调节了干旱胁迫下抗氧化酶活性的诱导,本试验检测了干旱胁迫下NO的产生情况。如图2所示,干旱胁迫下大豆根中NO产生情况与抗氧化酶活性变化趋势一致。PEG处理增加了NO的产生,与对照相比增加了89.3%;PTIO处理则完全抑制了干旱胁迫诱导的NO产生;L-NNA和NaN3处理均抑制了干旱胁迫下NO产生,与PEG处理相比均显著降低。这些结果进一步表明,干旱胁迫下NO参与了抗氧化酶活性的调节。

 

　　2.4干旱胁迫对大豆幼苗NOS和NR活性的影响

 

　　为了进一步弄清干旱胁迫下NO产生的来源,本试验检测了干旱胁迫下NOS和NR活性的变化。如图3所示,干旱胁迫下大豆根中NOS和NR活性变化趋势与NO产生趋势一致。PEG处理显著增加了NOS和NR活性,且NOS比NR增加的幅度大。结果表明,干旱胁迫下NO来源于NOS和NR两条途径,但是主要来源于NOS途径。