培养基转换法下香菇交配型的准确鉴定

摘要：在利用原生质体单核化对5个供试香菇（Lentinulaedodes）菌株进行常规交配型分析的基础上，采用培养基转换法对各菌株孢子单核体的交配型组合进行了鉴定。结果表明，应用培养基转换法可以观察到3种形态明显不同的菌落，即由A≠B≠配对形成的具锁状联合的绒毛状菌落、由A≠B=配对形成的无锁状联合的栅栏型菌落及由A=B≠配对形成的无锁状联合的绒毛状菌落。由于该方法可清楚区分通常无明确形态差异的A=B≠和A≠B=反应，因此，用于香菇孢子单核体交配型因子的准确鉴定是行之有效的。

　　关键词：香菇（Lentinulaedodes）；四极性；交配型分析；标准测交菌株

　　香菇（Lentinulaedodes）是一种食药用真菌，也是世界三大栽培蕈菌之一［1］。作为一种异宗结合的四极性担子菌，香菇的交配系统由两个非连锁的A、B交配型因子所控制，它们的子实体产生4种交配型（AxBx、AyBy、AyBx、AxBy）的有性孢子；只有两对因子均不相同的组合即AxBx＋AyBy或AyBx＋AxBy，才能正常结实并完成整个有性生活史［2，3］。

　　在食用蕈菌交配型分析的常规程序中，要点是要从供试单孢中找到代表4种交配型的标准测交菌株（T1、T2、T3和T4）［4］，因而通常需要随机挑选一定数量的单孢（如20个以上）进行两两配对［5］，工作量较大。原生质体单核化技术［6］的出现为交配型的鉴定提供了更可靠而简便的方法，因为标准测交菌株T1、T2可以直接利用该技术从供试单孢的亲本双核体获得。

　　通过交配型分析的常规程序可以明确T1和T2、T3和T4间均是A≠B≠；而对T1与T3、T1和T4、T2与T3、T2和T4间的关系，只可能知道有一个交配型因子相同，具体是哪个交配型因子相同却难以区分。为进行交配型因子的深入研究，或在分子生物学研究中要建立不同交配型的基因池时，需要对4种类型的担孢子的交配型进行准确鉴定。

　　在四极性异宗结合的模式蕈菌裂褶菌（Schizophullumcommune）中，4种不同的交配反应（A≠B≠、A=B≠、A≠B=及A=B=）能分别形成具锁状联合的菌落（“+”反应）、无锁状联合的平贴型菌落（“F”反应）、无锁状联合的栅栏型菌落（“B”反应）及形态无明显变化的单核菌落（“－”反应）。因此通过交配反应的菌落特征，能准确识别参试单核体的交配型［7］。在同为四极性异宗结合种的香菇中，具锁状联合的可亲和反应（A≠B≠）易于与3种不亲和反应相区别，但3种不亲和反应（A=B=、A=B≠和A≠B=）因无明显形态差异彼此无法明确区分，从而给产生不亲和反应的两个供试单核体的交配型因子的准确鉴定造成困难。Darmono等［8］开发了培养基转换法首次应用于蜜环菌（Armillariamellea）的交配反应的鉴定中，为香菇交配型的准确鉴定提供了一种新思路。

　　研究将在利用原生质体单核化方法对香菇进行交配型常规分析的基础上，试用培养基转换法对4种单孢的交配型进行准确鉴定，为深入研究香菇的交配型因子的结构等方面打下基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　供试香菇栽培菌株IB02、IB08由河南省科学院生物研究所提供，HL01由华中农业大学菌种厂提供，野生菌株GAN057、SHX002采集自野外环境。木屑代料培养基、PDA（马铃薯、葡萄糖）培养基、CYM（磷酸盐、硫酸镁、葡萄糖、酵母膏和蛋白胨）培养基、MYG（麦芽糖、酵母膏、葡萄糖）培养基、OWE（橡树木屑浸汁）培养基、SOJ（鲜榨橘汁）培养基和木屑培养基［8，9］的配制参照文献［8］、［9］所述的方法进行。

　　1.2方法

　　1.2.1双核菌株的栽培、担孢子的收集及孢子单核体的制备6月中旬，在玻璃瓶中装入木屑代料培养基，高压灭菌2h，冷却后接种，参照文献［10］所述的方法栽培后收获子实体，进行孢子的收集和孢子单核体的制备。

　　1.2.2标准测交菌株T1、T2、T3和T4的确定用原生质体单核化方法对双核菌丝体进行原生质体的制备［4］，将所得的原生质体再生菌株两两配对，以锁状联合的有无作为亲和与否的标准，选出一对可亲和的单核化菌株，分别命名为T1、T2，即为所需的标准测交菌株T1、T2。将上述标准测交菌株T1、T2与相应的孢子单核体进行配对，从与T1、T2都不亲和的配对中选出部分孢子单核体进行两两配对，再从这些配对中选出一对可亲和的孢子单核体，分别命名为T3、T4，即为所需的标准测交菌株T3、T4。

　　1.2.3单核体交配型的鉴定用4个标准测交菌株T1、T2、T3和T4与所有的孢子单核体进行配对，镜检配对菌丝锁状联合的有无，根据反应情况确定孢子单核体的交配型。

　　1.2.4鉴定交配型的培养基转换法两个单核体间的交配反应通过锁状联合的有无加以鉴定。凡有锁状联合的配对为A、B因子均不相同（A≠B≠）的亲和反应。A因子或B因子相同（A=B≠、A≠B=）的不亲和反应通过培养基转换法加以鉴定［8］：将两个供试单核体在OWE培养基上以25℃对峙培养10～14d后，沿与反应区相垂直的方向穿过两菌落切取4mm×30mm的菌块，转移至SOJ培养基上，于25℃继续培养10～14d。凡出现无锁状联合的绒毛状菌落为A=B≠的反应；凡出现无锁状联合的栅栏型菌落为A≠B=的反应。

　　2结果与分析

　　2.1原生质体单核体的鉴定及标准测交菌株T1、T2的确定

　　对5个供试双核菌株，先对相应的子实体进行组织分离培养以得到菌丝，再对菌丝进行原生质体单核化。酶解涂平板后置于25℃培养，5d左右即出现肉眼可见的白色再生菌落。挑取其中直径较小的菌落（生长相对慢，是单核的可能性较大）至PDA试管斜面培养基中继续培养，每天挑取一次，连续挑取（约7d左右）至平板长满菌丝不能再挑取为止。

　　对初步挑取到试管斜面的再生菌落菌丝进行镜检，无锁状联合的确定为单核体，最终每个双核菌株获得的原生质体再生单核体数量在54~80之间。交配型鉴定结果表明，属于每种双核菌株的原生质体再生单核体均可获得两种交配型（表1）。将两种交配型的单核体中一种命名为T1，另一种命名为T2；指定T1的交配型为AxBx，则T2的交配型可定为AyBy。T1、T2即为所需的标准测交菌株。

　　2.2标准测交菌株T3、T4的确定及孢子单核体交配型的常规分析

　　每个双核菌株分离到的后代单孢数量均达到50个以上。通过与标准测交菌株T1、T2的配对，从与T1、T2均不亲和的单孢中选出了一对不亲和的组合，即为所需的标准测交菌株T3和T4。

　　将每个双核菌株后代单孢与相应的4个标准测交菌株进行交配鉴定，将配对反应中仅分别与T2、T1、T4和T3亲和的单孢分别归为T1组、T2组、T3组和T4组，从而将相应的单孢分为4种类型。其中T1组、T2组的交配型分别为AxBx、AyBy；指定T3组的交配型为AxBy，则T4组的交配型为AyBx。

　　2.34类孢子单核体菌株交配型的准确鉴定

　　2.3.1培养基转换法与交配型的准确鉴定对每一种双核菌株的4组后代单孢，每组随机取3株，应用培养基转换法进行所有可能的6种组合（T1×T2、T3×T4、T1×T3、T2×T4、T2×T3、T1×T4）的配对，观察分析6×9＝54个配对在SOJ培养基上的反应情况，结果出现3种特征明显的反应。

　　表2列出了香菇双核菌株HL01的单核体在SOJ培养基上的配对反应结果，图1为香菇HL01出现3种特征明显反应的菌落的生长状况。从表2、图1可以看出，“+”反应表示具有锁状联合的绒毛状菌落，菌丝生长较快，出现这种反应的两个配对单核体交配型应该是A、B因子均不相同（A≠B≠）；“F”反应表示不具锁状联合的绒毛状菌落，菌丝生长相对较慢，出现这种反应的两个配对单核体交配型应该是A因子相同、B因子不同（A=B≠）；“B”反应表示无锁状联合的栅栏型菌落，两个配对单核体之间形成一条明显的排斥带，出现这种反应的两个配对单核体交配型应该是A因子不同、B因子相同（A≠B=）。

　　从表2可以看出，在6种配对组合中，T1×T2和T3×T4的菌丝反应均是一致的“+”反应，可以肯定它们交配型的关系是A≠B≠，即T1组与T2组是A≠B≠，T3组与T4组也是A≠B≠。这种结果实际上通过前面所述常规的交配型鉴定方法已经确定，在此用培养基转换法只是进一步验证一下而已。

　　T1×T3与T2×T4中均是“B”反应占大多数（8个“B”反应，1个不典型的“B”反应即“B-”反应）；T2×T3也是一致的“F”反应，T1×T4则是“F”反应稍占优势（5个“F”反应，4个不典型的“F”反应即“F-”反应）。从这些反应结果可以看出一种趋势，即T1×T3、T2×T4应该是“B”反应；T2×T3和T1×T4应该是“F”反应。

　　实际上，4对配对组合（T1×T3、T2×T4、T2×T3和T1×T4）的菌丝反应结果是可以相互印证的，例如，从T2×T3是一致的“F”反应这种结果可以推断，T1×T4也应当是“F”反应，而相对应的T1×T3与T2×T4则应当是“B”反应。

　　根据上述对表2及图1的分析可以得出，T1×T3和T2×T4的反应均为A≠B=，而T1×T4和T2×T3的反应则均为A=B≠。因此，在指定T1和T2的交配型分别为A1B1和A2B2的情况下，T3的交配型为A2B1，T4的交配型为A1B2。

　　2.3.2交配型的鉴定结果通过核迁移试验和培养基转换法最终鉴定出了各组单核体的准确的交配型（表3）。对HL01菌株，用OWE-SOJ培养基转换法鉴定T1、T2、T3和T4的交配型分别为A1B1、A2B2、A2B1和A1B2。

　　3讨论

　　在担子菌的交配型分析中，最可靠的方法是两两配对法，但在样本容量很大时该方法的工作量也显著增大。如本研究中HL01的189个后代单孢菌株如按此方法进行交配型的鉴定，需C1892=17766个配对。而用标准测交菌株法，理论上只需189×4＝756个配对，极大地减少了鉴定工作量。标准菌株法的至关重要的一点是要求4个标准测交菌株绝对准确、可靠。采用原生质体单核化的方法可以准确获得与亲本双核体交配型相同的T1（A1B1）、T2（A2B2）两种标准测交菌株。采用培养基转换法可以对4个标准测交菌株的交配型进行准确鉴定。

　　在香菇中，由于没有明确的形态差异，两种不亲和反应即A=B≠和A≠B=难以相互区别。在对四极性蕈菌进行常规交配型分析的过程中，测交菌株T3的选择是随机的，其交配型既有可能是AxBy，也有可能是AyBx［4］。在本研究中，将最早用于蜜环菌的交配反应鉴定的培养基转换法［8］应用于香菇孢子单核体的对峙培养，结果A=B≠配对形成绒毛状菌落，A≠B=配对形成栅栏型菌落，二者可以清楚地区分开来，从而有效地提高了交配型因子鉴定的准确性。

　　当然，在应用培养基转换法进行鉴定时，每种交配型的群体需要随机选取一定数量的单孢。因为从鉴定结果看，虽然菌落的形态只有3种类型，尤其是A=B≠配对形成绒毛状菌落，A≠B=配对形成栅栏型菌落，但也还是有一些例外的情况出现，如A=B≠配对也有形成类似栅栏型菌落的，A≠B=配对的栅栏型菌落也有不典型的。这种情况下，有一定数量的单孢配对组合便可以从众多反应中发现本质特征，从而有助于作出正确的判断。

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　　［8］DARMONOTW，BURDSALLHH.MorphologicalcharacteristicsofincompatibilityreactionsandevidencefornuclearmigrationinArmillariamellea［J］.Mycologia，1992，84（3）：367-375.

　　［9］林芳灿，张树庭．中国香菇栽培菌株不亲和性因子的分析［J］.华中农业大学学报，1995，14（5）：459-466．

　　［10］程水明.香菇单核菌丝生长速度与交配型分布的关系［J］.湖北农业科学，2007，46（5）：765-767.

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