摘要:建立了以超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱(UPLC-MS/MS)检测果汁和葡萄酒中27种工业染料的方法。样品经乙腈振荡提取,在盐析作用下分层,目标化合物转移至乙腈层中。目标化合物在梯度洗脱条件下经C18柱分离后采用多反应监测(MRM)模式进行检测。其中24种工业染料使用正离子模式检测,流动相为乙腈和0.1%的甲酸水溶液;其余3种工业染料则采用负离子模式检测,流动相为乙腈和水。结果表明:果汁中27种工业染料的定量限(LOQ)为0.1～50μg/kg,回收率为57.0%～117.7%,相对标准偏差为2.4%～17.7%。葡萄酒中的LOQ为0.2～50μg/kg,回收率为40.8%～109.4%,相对标准偏差为1.6%～17.9%。该方法操作简单,灵敏度高,实现了不同种类的工业染料的同时提取,适合于软饮料中非法添加工业染料的快速检测。

　　关键词:超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱;工业染料;果汁;葡萄酒

　　近年来,工业染料在食品中的非法使用问题频繁发生,如苏丹红、孔雀石绿等食品安全事件。尽管各国政府相继出台了应对措施,颁布了法规及标准,但是工业染料在食品中的非法添加仍然存在。继2005年2月英国发现350多种食品受“苏丹红Ⅰ号”污染之后,英国食品标准局又公布了在35种食品中发现“对位红”,国内也发现不法商贩用“碱性玫瑰精(罗丹明B)”在海虾上染色,用“碱性橙、酸性橙Ⅱ和间胺黄”在豆制品上染色。因此,为有效地控制工业染料在食品中的滥用,很有必要建立食品中非法添加工业染料的检测方法,防患于未然,以便能从容应对突发的食品安全事件。

　　目前检测食品中非法添加的工业染料的方法很多,包括免疫法、毛细管电泳法、电化学分析法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法。其中常用的方法是高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用方法。对于建立多组分的快速预警检测方法,要求其灵敏度高、选择性好并能够对化合物进行确认,而液相色谱-串联质谱法具备了上述特点。本研究将已知食品中非法添加的工业染料苏丹红Ⅰ～Ⅳ、对位红、孔雀石绿、罗丹明B、碱性橙、酸性橙Ⅱ、间胺黄等与其他苏丹类染料、致癌性分散染料分散橙11、致敏性分散染料分散蓝106、分散橙3、分散红1、分散蓝124、分散橙37和致癌性、致敏性分散染料分散蓝1、分散黄3等27种工业染料作为目标物质,建立了果汁和葡萄酒基质中多组分同时提取、同时检测的超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱(UPLC-ESI-MS/MS)筛选确证方法。

　　1、实验部分

　　1.1仪器与试剂

　　ACQUITYTM超高效液相色谱仪、Micromass?QuattroUltimaTMPt三重四极杆串联质谱仪(Waters公司);Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)。

　　苏丹红Ⅰ(C16H12N2O,纯度90.0%(质量分数,下同))、苏丹红Ⅱ(C18H16N2O,纯度88.0%)、苏丹红Ⅲ(C22H16N4O,纯度96.0%)、苏丹红Ⅳ(C24H20N4O,纯度92.0%)、苏丹红7B(C24H21N5,纯度91.0%)、苏丹红G(C17H14N2O2,纯度98.0%)、苏丹黄(C14H15N3,纯度99.0%)、苏丹橙G(C12H10-N2O2,纯度73.0%)、苏丹蓝2(C22H26N2O2,纯度99.0%)、甲苯胺红(C17H13N3O3,纯度68.0%)、对位红(C16H11N3O3,纯度95.5%)、孔雀石绿(C52H54-N4O12,纯度98%)、结晶紫(C25H30ClN3,纯度80.0%)、隐色孔雀石绿(C23H26N2,纯度92.0%)、隐色结晶紫(C25H31N3,纯度99.0%)、分散蓝1(C14-H12N4O2,纯度30.0%)、分散蓝106(C14H17N5O3S,纯度87.0%)、分散黄3(C15H15N3O2,纯度30.0%)、分散橙3(C12H10N4O2,纯度90.5%)、分散红1(C16-H18N4O3,纯度94.0%)、分散蓝124(C16H19N5O4S,纯度70.0%)、分散橙37(C17H15Cl2N5O2,纯度90.0%)、分散橙11(C15H11NO2,纯度93.7%)和酸性橙Ⅱ(C16H11N2NaO4S,纯度94.0%)均购于Dr.EhrenstorferGmbH;罗丹明B(C28H31ClN2O3,纯度99.0%)、碱性橙(C12H12N4·HCl,纯度85.0%)和间胺黄(C18H14N3NaO3S,纯度98.0%)均购于Acros公司。乙腈(色谱纯,DIMA公司);甲酸(98%,Acros公司);氯化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。用乙腈配制质量浓度为100mg/L(按纯度标示折算)的单标准储备液。

　　1.2样品预处理

　　称取5.00g果汁或葡萄酒样品于50mL塑料离心管内,加入1.00g氯化钠、20mL乙腈,涡旋混匀15s,振荡20min,静置2.0min分层,收集上层有机相于50mL刻度管内;剩余水相中再加入20mL乙腈提取;合并有机相,定容至50mL。样品溶液过0.22μm聚四氟乙烯滤膜,滤液供UPLC-MS/MS测定。称取5.00g果汁或葡萄酒空白样品,每份样品按上述萃取过程进行处理,得到的基质提取液用于稀释标准储备溶液及样品溶液。

　　1.3色谱-质谱条件

　　1.3.1正离子测定

　　色谱柱:ACQUITYUPLC?BEHC18(100mm×2.1mm,1.7μm);柱温:40℃;流动相:A相为乙腈,B相为0.1%(体积分数)甲酸水溶液;流速:0.3mL/min;梯度洗脱程序:0～10.0min,5%A线性升至100%A,保持3min。进样量:5μL。离子源:电喷雾离子源,正离子模式(ESI(+));毛细管电压:3.2kV;离子源温度:100℃;脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂气流量:540L/h。

　　1.3.2负离子测定

　　色谱柱、柱温、进样量同正离子测定。流动相:A相为乙腈,B相为水;流速:0.3mL/min;梯度洗脱程序:0～5min,50%A线性升至100%A,保持2min。离子源:ESI(-);毛细管电压:2.8kV;其他条件同正离子测定。

　　2、结果与讨论

　　2.1色谱-质谱条件的优化

　　参照27种染料的电离性质,通过流动注射泵连续进样,对每种染料的单标溶液进行全扫描,确定每种染料的电离方式和分子离子峰。其中24种化合物采用ESI(+)模式,3种化合物采用ESI(-)模式。在分别获得每个化合物的分子离子峰(母离子)后,进行二级质谱(子离子)扫描,优化碰撞能量,从中选出两个丰度比较高的子离子分别作为定性和定量离子,从而建立多反应监测(MRM)模式的质谱方法。

　　在流动相中加入0.1%甲酸能增加染料在正离子检测模式下的电离效率,促进[M+H]+离子生成,因此正离子检测模式下测定的24种染料组分以0.1%(体积分数)甲酸水溶液和乙腈作流动相,优化梯度洗脱条件。比较了ACQUITYUPLC?BEHC18及C8两种色谱柱的分离效果,发现两柱只显示出组分保留时间的差异,在分离度方面均可满足质谱检测的需要;相应的,负离子模式测定的3种染料则以乙腈和水为流动相梯度洗脱分离。为了使所监测的化合物都有足够的数据采集点,保证MRM色谱峰的真实性和灵敏度,实验中将24种正离子MRM分为5个扫描时间段,以控制每个时间段内的离子数目和驻留时间。果汁中添加27种染料的MRM色谱图。

　　2.2样品前处理方法的选择