一株产黑色素链霉菌的分类鉴定(2)

　　1.1.1 菌种来源菌株S3，大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus），宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii），荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），白假丝酵母（Candida albicans），以上菌株均由国家海洋局第三海洋研究所生物重点实验室保存。

　　1.1.2 主要试剂及仪器质粒提取试剂盒购自上海生工;DNA marker、dNTPs、Taq酶等购自Takara公司;Biometre公司PCR扩增仪（T3）;Eppendorf公司微型台式离心机;日本JEOL公司JEM-1230透射式电镜;德国Bruker公司TENSOR 27型红外光谱仪。

　　1.1.3 培养基 2216E细菌培养基;Tyr发酵培养基[5];酪素培养基[6]及国际链霉菌计划（ISP）推荐的7种培养基[7];LB培养基;黄豆粉煮汁培养基：黄豆粉40 g，冷水调糊后加至1 L煮20 min，经纱布过滤，加入葡萄糖20 g，定容至1 L;孢子形成培养基[8];以上培养基均以人工海水与蒸馏水各半配置，1×105 Pa灭菌30 min。

　　1.2 方法

　　1.2.1 样品采集及菌种分离从厦门石胄头（退潮后的上浮水）、筼筜湖、白城、芙蓉湖、船坞（退潮后的沉积物）采集到5个样品，分别取未稀释的水样及10倍稀释的水样和泥样，涂布于2216E、Tyr及酪素平板上，于28 ℃培养5 d，挑取呈黑色的菌落，进行分离纯化。从石胄头海水中分离到菌株S3。

　　1.2.2 发酵培养及抑菌试验将菌株S3在Tyr发酵培养基活化3 d，分别接种于LB培养基和黄豆粉煮汁培养基，28 ℃，180 r/min摇床培养10 d。取发酵液分别接种涂布有待试菌平板的滤纸片上，28 ℃培养检测抑菌活性。

　　1.2.3 孢子形态及培养特征观察将菌株S3接种于ISP、2216E和产孢等培养基，28 ℃培养观察菌丝生长变化，利用电子显微镜观察孢子链和孢子形态。

　　1.2.4 黑色素的提取及鉴定将菌株S3接种于Tyr发酵培养基，发酵5 d，提取黑色素参考文献[9，10]。取黑色素纯品少量，用溴化钾压片法测红外吸收光谱。

　　1.2.5 生理生化的测定参照文献[7，11，12]相关内容。

　　1.2.6 菌株的鉴定菌体于液氮迅速冷冻15 s，其余步骤参考文献[13]并加以改进。PCR扩增采用的引物为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），反应条件：95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 S，56 ℃ 40 S，72 ℃ 2 min，30循环;72 ℃ 10 min。PCR产物用经检测割胶纯化，连接到载体PMDt-vector，转化到感受态细胞E.coli DH 5a中37 ℃培养检测，挑取单菌落37 ℃液体培养过夜，利用试剂盒提取质粒，经酶切鉴定，送交上海美吉生物技术有限公司测序，测序引物为P300（5′-CCAGACTCCTACGGGAGGCAGC-3′），RP500（5′-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3′），PKCT（5'-TGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG-3'）。测序结果用EzTaxon Server version2.1数据库对菌株的16S rDNA序列进行分析，然后用MEGA 4.0软件采用邻接法算法构建系统发育树，并进行亲缘性分析。

　　2 结果与分析

　　2.1 菌株S3的形态及培养特征

　　菌株S3在LB、黄豆粉煮汁培养基中发酵10 d，发酵液除了对黑曲霉有较弱抑制作用外，对其余试验菌株均无抑菌活性。在LB、2216E、Tyr、产孢等培养基上生长2～5 d，菌落呈白色，菌落较小，圆形，突起，光滑（培养一段时间后菌落较干燥），不易挑取，显微镜下菌体呈丝状，菌落周围产生可溶性黑色素，基内菌丝和气生菌丝不发达。在产孢培养基上培养约15 d，有孢子产生，孢子呈白色，椭圆，表面光滑（图1）。菌株S3在ISP培养基上培养5 d，生长状况见表1。在ISP1、ISP3和ISP4上生长良好，气生菌丝白灰色或浅黄色，基内菌丝呈浅黄色;在ISP2、ISP5、ISP6和ISP7上生长较弱，气生菌丝呈白灰色或灰色，基内菌丝在ISP2和ISP5上呈黄色，在ISP6和ISP7上呈灰色，在ISP1、ISP4和ISP5上产生可溶性黄色素，而在ISP7上产生可溶性黑色素。

　　2.2 菌株S3的生理生化特征

　　挑取菌株S3的新鲜菌体于3% KOH中，无拉丝现象，革兰氏阳性，H2S、VP及明胶液化试验呈阴性，酶触试验呈阳性，铜离子（0.1 g/L）利于其产生黑色素。菌株S3不利用柠檬酸和木糖，对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖及甘油利用较好，以蛋白胨或酵母膏为氮源时生长较好，在无机氮源上生长较慢（表2）。

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