茶苗根系分析取样:每个处理随机挑选5株茶苗并分别标记。处理开始后,每周测定一次,连续测定5周,测定前将茶树幼苗根系洗净后进行根系形态特征分析,每次测定完成后,将分析数据分类保存,并将上述标记茶树幼苗分别置于相应的水培槽中继续培育,以供下次根系分析。 1.2 测定项目与方法 茶汤制备:将烘干的茶样,在磨碎机中磨成粉末过40目筛,分别称取0.600 0 g粉碎茶样置于100 mL锥形瓶中,加入约80 mL沸水,在恒温水浴锅中100 ℃水浴45 min,每隔10 min摇晃一次,使茶样中的内含成分被充分浸提。浸提结束后,浸提液趁热抽滤,残渣用热去离子水洗涤2~3次,滤液冷却后定容至100 mL容量瓶中。 茶多酚总量的测定参照GB/T 8313—2002,采用酒石酸亚铁比色法。游离氨基酸总量测定参照GB/T 8314—2002,采用茚三酮比色法。儿茶素、咖啡碱含量的测定采用高效液相色谱法,参考GB/T 8313—2008的检测方法,并略作修改。流动相A:乙腈90 mL,乙酸20 mL,10 mg/mL EDTA溶液2 mL,去离子水定容到1 000 mL;流动相B:甲醇。色谱条件:检测波长278 nm,柱温35 ℃,流速1 mL/min,进样量40 μL,运行时间45 min。梯度条件如表1所示。 茶叶中茶氨酸含量测定采用高效液相色谱法[6]。色谱仪为Agilent 1100 Series,色谱柱Symmetry-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为0.05%三氟乙酸水溶液,流速为1.0 mL/min,进样量为10 μL,检测波长为203 nm,柱温30 ℃,检测时间10 min。每次进样结束后,用乙腈冲洗色谱柱10 min,然后用流动相平衡色谱柱约10 min,至基线平稳,再进行下一组样品的测量。 茶树幼苗根系形态分析,采用多功能根系扫描分析仪(EPSON Perfection Flatbed Scanner V700/V900)进行测定,分析总根长、总表面积、平均直径、 根尖数等指标。 各处理均进行3次重复,试验数据采用MS Excel 2003、SAS V8.0统计软件进行统计分析,利用LSD法检验差异显著性。 2 结果与分析 2.1 钙过量对茶多酚含量及儿茶素组成的动态影响 前2周钙过量处理与对照茶叶茶多酚含量差异显著,之后差异不显著(表2)。钙过量处理前2周,随着钙离子浓度的增加,茶多酚含量均表现出先增加后降低的趋势,T2处理茶多酚含量最高,分别达到27.51%和27.15%;钙过量处理3~5周,这种趋势发生改变,处理间茶多酚含量差异均不显著。儿茶素总量的变化趋势与茶多酚一致,经过前2周钙过量处理,茶苗新梢儿茶素的组成如图2所示,钙过量条件下表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)的变化比较大,其他儿茶素变化较小,因此,钙过量处理条件下儿茶素总量的变化主要是EGCG和ECG引起的。 2.2 钙过量对游离氨基酸、茶氨酸含量的动态影响 钙过量处理前2周各处理间茶叶游离氨基酸和茶氨酸含量差异不显著,处理3周后二者含量均开始表现出差异(表3)。处理前2周,游离氨基酸和茶氨酸含量一直比较稳定,变化幅度很小;从第三周至第五周,与对照相比,游离氨基酸和茶氨酸含量随着钙离子浓度的增加显著降低;处理第三周,150 mg/L钙离子浓度(T2)处理条件下开始显著下降;而处理第四周和第五周,90 mg/L钙离子浓度(T1)处理条件下即开始显著下降。 2.3 钙过量对咖啡碱含量的动态影响 与对照相比,茶叶中咖啡碱含量在钙过量处理条件下存在明显差异(表4)。从第一周至第五周,随着钙离子浓度的增加,咖啡碱含量均出现不同程度的下降。其中前3周咖啡碱含量下降幅度较小;而处理第四周后,咖啡碱含量出现大幅度下降,与对照相比,T1处理条件下即开始出现显著下降,T4处理条件下咖啡碱含量下降0.43个百分点。 2.4 钙过量对根系形态的动态影响 植物地上部分的生长发育与根系关系密切,本试验在测定茶苗新梢品质成分的同时,利用根系分析仪对根系总根长、总表面积、平均直径、根尖数进行了分析。钙过量处理对根系的影响主要表现在根尖数的显著减少,而总根长、总表面积及平均直径的变化不显著(表4)。根尖数的减少幅度随着钙离子浓度的增加而增加,T1处理条件下,经过5周培养,相对于第一周,根尖数减少了67.4,T4处理条件下根尖数减少量为99.80。随着钙过量处理时间的进一步延长,茶树根系的吸收根不断衰亡,直至根系失去吸收功能,同时茶树新梢也逐步干枯。 3 讨论和结论 Ca2+被认为参与促进细胞壁增厚、植物防御素合成及改变活性氧[7]。植物在正常的生长情况下,活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。论文检测钙过量胁迫可引起茶树光合系统膜结构的破坏,而叶绿体和线粒体是植物体内活性氧产生的主要部位[8],胁迫处理增加了植物体内活性氧的产生。植物体内存在的负责清除活性氧产生的抗氧化系统由两部分组成,即抗氧化酶类和抗氧化剂类,二者在植物体内都可清除活性氧。茶多酚是一类以儿茶素类为主体的类黄酮化合物,具有C6-C3-C6碳骨架结构,是重要的天然抗氧化性物质,可对活性氧起到一定的清除作用[9]。本试验中,钙过量胁迫处理初期,较低钙浓度(90、150 mg/L)条件下,茶树体内茶多酚含量的增加可在一定程度上降低胁迫造成的危害,而随着钙浓度的增加或胁迫时间的延长,茶多酚消耗量增加,含量逐步降低。 氨基酸是茶叶中的主要滋味物质,能缓解茶的苦涩味,增强甜味,还可以转化成各种香气物质,与茶叶品质呈正相关[10,11]。茶氨酸是茶树中含量最高的游离氨基酸,占茶叶干重的1%~2%[12]。茶氨酸是由根系吸收无机态氮,在茶根部由乙胺与L-谷氨酸生物合成,再经由输导组织运往地上部分,最终运往茶树的各个组织[10]。高钙土壤条件下,高浓度Ca2+会抑制嫌钙植物对其他金属离子的吸收、铵盐的硝化,尤其是对有些嗜好氮肥的嫌钙植物[13]。茶树是典型的嫌钙嗜氮植物,高浓度Ca2+势必会抑制铵盐的硝化;此外,钙过量条件下,茶树根系根尖数减少,且高Ca2+浓度下根系表面会附着一层白色黏膜,这些都会导致根系合成茶氨酸的能力下降。本试验中,钙过量处理2周后,游离氨基酸、茶氨酸含量的显著降低证明了该观点。咖啡碱是茶叶中的另一重要滋味物质,其与茶黄素以氢键缔合后形成的复合物具有鲜爽味,是影响茶叶品质的重要组分[14]。茶叶中的嘌呤可能是在叶绿体中从先质直接合成,这些嘌呤又可以在这里转化成咖啡碱[10]。王跃华等[4]研究表明,钙过量胁迫导致叶绿体膜损伤,基质类囊体片层变得松散,类囊体膜也受到不同程度的破坏。这势必会影响咖啡碱的合成。此外,钙过量条件下,茶树根系根尖数减少,影响根系对氮素的吸收,从而影响到茶树新梢中咖啡碱的合成。本试验中,钙过量处理1周后,咖啡碱含量出现显著降低。 |