一种简单高效的水稻体细胞诱变育种新方法(2)

　　2.1继代时间对植株再生的影响
　　已有研究发现[15]，组织培养的体细胞变异频率随培养时间的延长而提高.但是随着培养时间的延长，其愈伤组织的分化频率也急剧下降，往往导致再生苗分化的极度困难.因此，我们首先研究了继代时间对植株再生的影响，以寻找愈伤组织的最佳继代时间.以25d为一个培养周期，挑取刚从株1S幼穗诱导出来的颜色淡黄、质地致密的胚性愈伤组织于继代培养基进行继代培养，分别继代0～9个周期，然后转接到分化培养基上观察并统计分化频率.其中，继代0周期的胚性愈伤组织即为刚从幼穗诱导出来的胚性愈伤组织转接到分化培养基.实验结果发现，当继代4个周期以上，其愈伤组织的分化频率急剧下降，由继代3个周期时的59.0%急降至15.8%左右（图2（a））.因此，为了保持较高的分化频率和变异频率（由继代时间决定），我们认为在高浓度2，4D诱变处理前的最佳继代时间为3个周期.
　　2.3不同外植体对诱变频率的影响
　　在水稻组织培养中，一般选用幼穗、幼胚和成熟胚作为外植体[13，16-17].在3种外植体中，究竟哪种最适合作为体细胞无性系变异的外植体呢？迄今还未见相关研究内容的文献报道.于是我们研究了水稻幼穗、幼胚和成熟胚等3种外植体对诱变频率的影响.研究结果发现，由幼穗诱导的愈伤组织的诱变频率达到了24.7%，由幼胚诱导的为5.2%，而由成熟胚诱导的仅为3.8%（图2（c））.在单一性状的变异方面，由幼穗诱导的愈伤组织的诱变频率也很高.如由株1S幼穗诱导、诱变和再分化得到的500株分化苗中，经在海南陵水基地的表型鉴定，发现共有24株表现出株高不同程度的矮化.就株高性状的变化来说，其突变率达到了4.8%（24/500）（表2）.而由成熟胚诱导的愈伤组织经诱变和再分化后得到的分化苗中，几乎没有发现矮化突变株（结果未列出）.由此可以看出，在体细胞无性系诱变的外植体中，幼穗明显优于幼胚和成熟胚.其可能的原因是处于花粉母细胞形成时期的水稻细胞在离体培养条件下对外界环境更敏感，更易发生变异.另外，幼穗作为外植体还有具有愈伤组织诱导率高和活力强等优势（结果未列出）.因此，体细胞无性系诱变育种的最佳外植体为幼穗.
　　2.4不同品种的体细胞突变频率的分析
　　通过上面以株1S为材料进行的继代时间、2，4D浓度和不同外植体对诱变和分化频率的影响，初步建立了以幼穗为外植体，以4.0mg/L2，4D为最佳诱变浓度的体细胞无性系诱变方法.为了进一步验证该方法的有效性，我们对包括株1S在内的水稻品种中9B，R527和316B等进行了无性系诱变.为了实验的准确性，仅以单一性状的突变进行统计分析.在生产中，株1S，中9B和R527的株高偏高，导致所配组合抗倒伏性差，而316B的种子颖壳闭合度差，容易导致种子霉变和发芽率降低.因此，在株1S，中9B和R527中，以矮秆或半矮秆突变株系进行统计分析，而316B则以种子颖壳闭合度好的突变株系进行统计分析.实验结果发现，诱变频率最高的是株1S，在500株分化苗中共得到了24个矮化变异株系，其诱变频率达到了4.8%（24/500）.诱变效率最低的是316B，在236株分化苗中仅得到了1个种子颖壳闭合度较好的突变株系，其诱变频率仅为0.42%（1/236）.中9B和R527分别为2.33%和1.42%（表2）.由此说明，体细胞无性系的突变率还取决于品种间的基因型差异.
　　2.5矮秆突变株系的表型分析
　　在株1S的24个SV矮化突变株系中，选取了SV5S，SV10S和SV14S等3个综合农艺性状较优的变异株系，对它们的株高和各节间长度进行了分析.由于在不育状态时不育系水稻的穗不能完全从旗叶的叶鞘中伸展出来，对植株高度的测量产生很大的影响[18-19].因此，亲本株1S和其SV突变体（R3）都是经20℃低温处理使其育性恢复后于成熟期测量株高及节间长度（表3）.从表中的统计结果可知，在株高上出现株1S，SV10S，SV14S和SV5S依次变矮的顺序，其节间特别是基部的节间明显缩短，而穗长却缩短幅度很小.该结果说明，矮化突变体能显著提高抗倒伏性.通过进一步综合农艺性状的鉴定和评价，发现SV14S的各种农艺性状更加优良[13].于是我们检测了株1S和SV14S各节间及整个茎秆的单位长度干物质含量，以进一步研究SV14S的抗倒伏能力.实验结果发现，除了第一节间外，SV14S其它节间的单位长度干物质含量均比亲本株1S高（表4）.该结果说明，突变体SV14S既能增加抗倒伏性，又能提高产量.杂交配组实验也进一步说明了SV14S的优良抗倒伏性能.如SV14S与恢复系912的杂种后代（F1）的抗倒伏性明显优于株1S与912的杂种后代（结果未列出）.因此，突变株系SV14S在杂交水稻育种中具有良好的应用前景.另外，我们还对突变株系SV14S进行了相关分子生物学分析，并在基因水平上证明该突变体确实发生了稳定变异，具体结果见先前发表的相关文章[14，20-21].
　　在中9B的5个SV矮化突变株系中，经过3～4代的考察和评价，选取了其中综合农艺性状最优的矮化株系命名为SV9B，并对其农艺性状进行了考察和评价.图3显示了SV9B和对照亲本中9B的植株形态、株高和各节间长度.从图可知，中9B和SV9B的植株高度分别为93cm和75cm，SV9B的株高明显低于对照亲本中9B（图3（a）和（b）），而且SV9B的各节间均缩短，其中基部节间长度缩短明显，而上部节间长度缩短幅度较小（图3（c）和（d））.特别是SV9B的III节间的缩短幅度最大，还不到中9B的III节间长度的一半.另外，我们还测量了中9B和SV9B成熟穗的农艺性状（图4和表5），发现与对照亲本中9B相比，SV9B的穗长几乎没有变化，初级小穗数和千粒重稍微降低，而次级小穗数和每穗粒数却显著增加.同时，SV9B的种子比中9B的种子更加饱满（图4（c））.这些结果说明，突变体SV9B不仅增加了抗倒伏性，而且提高了单株产量，具有良好的应用前景.
　　优良矮秆突变株系SV14S和SV9B的成功选育为后续的传统杂交育种提供了优质种质资源.随后，以SV14S与优质抗稻瘟病父本ZR02杂交，通过“人工低温与自然低温双重压力选择”和定向培育，育成优质两用核不育系湘陵628S（品种授权号：CNA20070803.1）.用该亲本选配的杂交组合在国家和湖南省区试评比中农艺性状表现优异（结果未列出），已获准大面积商业推广.如超级杂交早稻组合陵两优268，两年国家区试第一名，已通过国家审定.同样，利用SV9B与三系胞质不育系T98A测交、多代回交选育出抗倒伏的优质三系胞质不育系SV916A，利用该亲本选育的优质超级杂交稻组合即将应用于生产.总之，这些卓有成效的育种成果的取得进一步证实，利用幼穗为外植体和2，4D为诱变剂的水稻体细胞诱变育种方法是一种简单有效的新型育种方法.同时也说明，在整个诱变和后续的选育过程中，如果结合一定的选择压力可以有效加快育种进程.
　　3结论
　　在本研究中，通过研究继代时间、2，4D浓度和不同外植体对诱变和分化频率的影响，初步建立了以幼穗为外植体、诱变前继代培养时间为3个周期（约75d）以及以4.0mg/L2，4D为最佳诱变浓度的体细胞诱变育种方法.同时，利用该方法诱变株1S和中9B，分别成功选育到了优良矮化突变株系SV14S和SV9B，为后续的传统杂交育种提供了优质种质资源.这些育种成果的取得进一步证实了该水稻体细胞诱变育种方法是一种简单有效的新型育种方法.
　　参考文献

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