高温胁迫下草坪草高羊茅差异表达基因的分子研究(2)

　　1.1.2 试剂 RNAiso-mate for Plant Tissue，D325S，TaKaRa；RNAisoTM Plus，D9108B，TaKaRa； PCR-Select cDNA Subtraction Kit，637401，Clontech；Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit，635000，Clontech；QIAquick PCR Purification Kit，28104，Qiagen；Advantage 2 Polymerase Mix，639201，Clontech；DL2000，条带依次为2 000，1 000， 750，500，250，100（Marker），D501A，TaKaRa。

　　1.2 试验仪器

　　PCR仪，ABI 9700型PCR扩增仪；离心机，5418型，eppendorf；凝胶成像系统，Tanon 2500，天能公司；紫外分光光度计，GeneQuant II，Pharmacia Biotech。

　　1.3 试验方法

　　1.3.1 高羊茅总RNA提取与mRNA的分离、纯化取50～100 mg组织于液氮中研磨，加入1 mL缓冲液提取组织总RNA。将总RNA溶于DEPC-H2O，用Dnase I 37 ℃处理30 min，抽提纯化RNA。用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对总RNA的浓度及纯度进行检测。

　　1.3.2 高羊茅SSH文库的构建将提取出的RNA反转录合成cDNA，然后对cDNA进行纯化以及cDNA RsaI酶切，将双链cDNA消化成短的平端cDNA片段，便于下一步的差减和接头连接，具体可参考PCR-Select cDNA Subtraction Kit说明书。接头连接和差减杂交，进行两轮差减杂交，并且对两轮差减杂交结果进行差减PCR。纯化PCR产物，提取4 mL，并用TaKaRa公司的PMDl9-T Vector连接消减杂交片段。用氯化钙二次重悬法制备感受态大肠杆菌。取出储存于-80 ℃的大肠杆菌菌株的保存菌液，37 ℃下，转速为225 r·min-1，扩大培养约至2.5～3.0 h，OD600=0.4时结束。将0.1 mol·L-1CaCl2溶液冰水浴冷却，提取2 mL并轻轻震荡菌体至均匀，冰水浴30 min后，得到感受态细胞悬液；加入5 mL连接产物，在恒温振荡器上复苏培养80 min，让受体菌恢复正常生长； 37 ℃在LB固体培养基平板上均匀涂布Amp（50 μg·mL-1）、x-gal（80 μg·mL-1）和IPTG（0.5 mmol·L-1），倒置培养于恒温培养箱中14～16 h，直至长出大小合适的蓝、白菌落。取白色饱满菌落置于96细胞培养板，于37 ℃下静置培养16～20 h，加入13 μL甘油（甘油经过高压蒸汽灭菌）混匀，-70 ℃保存，即可建成SSH文库。

　　1.3.3 斑点杂交根据下列方阵点膜，每个点各取0.6 μLPCR产物（插入片断鉴定PCR产物）。

　　2 结果与分析

　　SSH和基因芯片技术的相结合是从阳性克隆中筛选差异基因比较理想的方法，它在一次杂交中就可对成千上万的基因进行检测，但是首先要有预先制备好的基因表达谱芯片。制备一张较完备的基因芯片经费要求较高，需要对研究对象的遗传背景有较好的了解。另外，运用基因芯片研究基因表达时，低丰度的基因往往难以检测出来。因此，对于一些遗传背景不清晰的物种来说，利用传统意义上的基因芯片技术研究其在不同代谢或生理状态的基因表达谱的变化是困难而且不经济的。因此，将斑点印迹技术应用于抑制消减杂交差别表达基因克隆的初筛，一方面可以鉴定文库质量，更重要的是可以进一步剔除文库中的假阳性克隆，真正获得目的优势表达的基因。本试验即在应用SSH技术建立高羊茅耐热基因抑制消减文库，然后使用斑点印迹技术对差别表达基因克隆进行初步筛选，获得阳性克隆。

　　根据阳性克隆信号强弱的数据，变化倍数取log2，然后进行升序排列的结果，得到上调和下调结果。上调的基因为91个；下调基因为22个，这两部分数据与草坪草抗热性的获得显著相关，是研究所关注的基因组，将进一步对其进行测序和分析。其余还有下调基因145个，这部分基因与抗热性的获得相关，但不是关键基因，这部分数据可以作为选测数据，以便对抗热相关基因进行测序和生物信息学分析。

　　3 讨论

　　在本研究中，为了从已构建好的消减文库中筛选差异表达基因，分别以正向和反向SSH探针与尼龙膜上的消减cDNA质粒进行杂交，消减cDNA质粒与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的质粒，经相应的显色反应显出杂交信号。通过杂交信号的强度差异筛选出阳性克隆。

　　当植物受到高温胁迫时，正常的生理过程受到干扰，细胞代谢紊乱。同时，植物也可以通过应激反应延缓或者阻止伤害的发生。有关逆境生理和抗性调控机理已经进行了大量的研究[7-10]，试验表明：在植物受到胁迫时，体内的各种生化指标都会发生变化，甚至产生一些新的蛋白，如热激蛋白，保护植物免受或延缓伤害[11]。现有研究已经知道植物对环境产生的大多数生理响应都得通过改变基因表达来实现。进一步的研究发现在中等胁迫或者外源物质的刺激下，各种保护机制也会快速反应[12]，从而减轻了进一步的胁迫对植物体造成的伤害。可见，抗逆基因的响应远远早于生理指标的变化。

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