摘要：试验通过PCR-SSCP技术检测略阳乌鸡酪氨酸酶基因（TYR）部分启动子区、全部外显子和部分内含子的遗传多样性，并对不同基因型进行了测序和比对分析。结果表明，略阳鸡群体在TYR位点具有较为丰富的遗传变异，在所检测的启动子区有2个单核苷酸多态（SNP）位点；外显子1有2个SNP位点，外显子2、3、4没有检测到变异位点，外显子5存在5个SNP位点；检测的部分内含子2中发现2个SNP位点。mRNA上的7个变异位点有3个发生在编码区，但都是同义突变，没有造成氨基酸变异。表明略阳乌鸡和普通鸡的酪氨酸酶没有氨基酸序列差异，TYR基因在鸡的遗传上是高度保守的。启动子区和内含子区的遗传变异是否与酪氨酸酶的转录剪接和表达量有关，进而影响乌鸡黑色素的沉积还有待进一步研究。

 

　　关键词：略阳乌鸡；酪氨酸酶基因（TYR）；遗传变异

 

　　中图分类号：S831；S813.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1123-05

 

　　略阳乌鸡又称黑河乌鸡，具有“六端乌”（乌皮、乌喙、乌腿、乌趾、乌舌、乌冠），体形大，生长快、产肉多、肉质细嫩鲜香，营养丰富，兼有药用价值，属优良肉用型地方鸡种，其羽色复杂，有黑羽、麻羽、白羽等，是经过长期选育形成的宝贵资源，主要分布于秦岭以南略阳县的黑河坝、观音寺、仙台坝、两河口等地，是陕西省惟一的家禽保护品种，农业部专家组来略阳调研时，将其与泰和乌鸡、郧阳乌鸡、江山乌鸡共同列为中国四大乌鸡品种，2008年被确立为“中国地理标志产品” [1-4]。

 

　　乌鸡的滋补、药用价值主要是与其体内丰富的黑色素有关， 黑色素具有延缓衰老、清除自由基、抗氧化、抗诱变、抗紫外线、抑制流感病毒等多种生理功能[5-10]。动物黑色素可分为两类， 一是真黑色素（Eumelanin）， 不含硫原子， 呈棕色或黑色； 二是脱黑色素（Pheomelanin），含硫原子， 呈黄色或微红棕色，乌骨鸡黑色素属于真黑色素，主要分布于乌鸡的羽毛、皮肤、骨骼和肌肉中[11，12]。黑色素沉着决定于其所含真黑色素与脱黑色素的相对数量，而黑色素细胞中酪氨酸酶活性和表达量与两种黑色素合成量比例呈正相关[11，13]。

 

　　酪氨酸酶是控制黑色素生成的限速酶，酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成3， 4-二羟基丙苯氨酸（多巴）， 多巴进一步氧化生成多巴醌， 多巴醌经多聚化反应与氧化反应生成多巴色素， 在多巴色素异构酶作用下， 多巴色素羟化为5， 6-二羟基吲哚羧酸（ DHICA） ， 脱羧成5， 6-二羟基吲哚， 再在酪氨酸酶催化下氧化成5， 6-吲哚醌， 最后与其他中间产物结合形成真黑色素。脱黑色素合成前期（酪氨酸到多巴醌）与真黑色素一致， 但在以后反应中有半胱氨酸（Cys） 参加， 产生Cys-多巴和Cys-多巴醌， 然后通过关环、脱羧、最终形成脱黑色素[13]。家禽中真黑色素的合成目前多遵循经典的Mason-Raper途径，鸡的酪氨酸酶基因（TYR）定位在1号染色体的长臂4区4带[12，14]。

 

　　本研究以略阳普通鸡、略阳麻羽乌鸡与略阳黑羽乌鸡3个群体为对象，通过PCR和测序技术检测略阳鸡TYR基因的SNP，分析略阳鸡TYR基因的遗传变异对黑色素形成的影响，探讨略阳乌鸡黑色素形成过程中TYR的分子作用机制，为开发利用这一宝贵资源提供理论基础。

 

　　1 材料与方法

 

　　1.1 材料

 

　　从陕西汉中黑凤乌鸡产业园采集21只略阳黑羽乌鸡（LYHY）的血液，汉中农贸市场采集略阳普通鸡（LYPT）和略阳麻羽乌鸡（LYMY）各1只的血液，加ACD抗凝，置于-70 ℃低温冰箱中保存， 根据《分子克隆实验指南》[15]，采用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE中，4 ℃保存。

 

　　1.2 引用序列及引物序列

 

　　从GenBank查得鸡的TYR基因序列（GenBank登录号：L46805 和NC006088）， TYR外显子1及上游序列引物引自文献[16]，采用Primer5.0自行设计TYR外显子2-5的引物，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成（表1）。

 

　　1.3 PCR扩增反应体系及程序

 

　　PCR反应总体系为25 μL：10×PCR缓冲液

 

　　2.5 μL， dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上下游引物

 

　　（10 pmol/L）各1.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）

 

　　0.2 μL ，DNA模板（50 ng/μL）1.2 μL，超纯水18.2 μL。

 

　　PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55～60 ℃（表1）退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行34个循环；72 ℃延伸7 min；12 ℃保存。

 

　　1.4 SSCP检测

 

　　取2 μLPCR产物与8 μL上样缓冲液（95%甲酰胺， 0.25%二甲苯青，0.25%溴酚蓝， 20 mmol/L EDTA）混匀，放入沸水煮沸10 min，立即取出冰浴30 min，取混合物于12%的聚丙烯酰胺凝胶180 V电泳18 h后进行银染[17]。

 

　　1.5 DNA测序与分析

 

　　对SSCP技术检测出的不同基因型的个体进行扩增，对PCR产物进行测序，然后进行比对和拼接，采用DNAMAN 5.0软件对略阳乌鸡TYR基因序列和NCBI公布的鸡TYR基因序列进行比对分析。

 

　　2 结果及分析

 

　　2.1 不同类型略阳鸡TYR基因SSCP检测结果

 

　　鸡的TYR序列总长49 778 bp（NC006088），有5个外显子，mRNA全长1 935 bp，编码区为

 

　　1 590 bp，编码529个AA。通过SSCP检测所研究群体的遗传多样性，发现在启动子区有2种基因型AA和BB型；外显子1的5号引物检测到AA、AB和BB 3种基因型；外显子1的6号引物也存在AA、AB和BB 3种基因型。外显子2、3、4没有发现多态性，只检测到一种基因型。外显子5的1号引物有2种基因型（AA、AB型）；2号引物检测到3种基因型（AA、AB和 BB型）；3号引物也检测到3种基因型（AA、AB和BB型），各基因型在略阳鸡中的频率见表2。

 

　　2.2 略阳鸡群体TYR基因序列变异分析

 

　　对不同的基因型进行测序发现不同位点各基因型DNA水平的单核苷酸遗传变异（图1-9）。以NCBI公布红色原鸡TYR基因序列为参照，采用DNAMAN5.0 软件对略阳普通鸡、略阳麻羽乌鸡和略阳黑羽乌鸡TYR部分启动子区、外显子区和部分内含子区进行序列比对，发现略阳乌鸡群体中的多数个体启动子区-392和-409位点由G→A（图1、图2），外显子1的第757位点C→T（图3），第849位点C→T（图4），外显子5的第49351位点C→T（图7），第49567位点A→G（图8），第49663位点G→C，第49672位点T→A，第49692位点C→G（图9）。对略阳麻羽乌鸡、略阳普通鸡、略阳黑羽乌鸡、红色原鸡TYR基因编码区进行翻译和比对，发现在编码区第757位点、第849位点、第49351位点3个碱基存在遗传变异，但是其中均为同义突变，并不导致氨基酸序列的改变。对于启动子区和内含子区的碱基变异是否影响略阳鸡TYR基因的表达量，进而影响黑色素的形成还有待进一步研究。

 

　　3 小结与讨论

 

　　乌鸡在表型性状上与普通鸡最明显的差异是体内含有大量黑色素，酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶， 其表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量[18]。另有研究发现黑色素的合成是由多个基因位点编码产物共同参与与调控的级联过程[19]。Levine[20]提出至少有4个TYR基因家族成员参与黑色素的合成，由于酪氨酸酶的重要性，编码酪氨酸酶的基因也就成了研究黑色素性状和白化病的热点候选基因。鸡的TYR位点是复等位基因位点，鸡的第1外显子6个核苷酸的缺失导致白化，这些核苷酸编码天冬氨酸和色氨酸，而这2个氨基酸从两栖动物到人都是保守的，可见这2个氨基酸在结构和功能上都起着重要作用[21，22]。目前鸡的TYR基因的全序列和控区序列均已完成测序，但在不同家禽品种上的研究相对较少，陈志强等[23]通过研究明星肉鸡与丝羽乌鸡的TYR基因5′调控区单链构想多态，发现调控区有3个SNP，并且这些SNP位点与鸡的胫色和肤色显著相关。张建勤等[24]、Zhang等[25]采用PCR-SSCP方法，对中国宁夏固原鸡、海南文昌鸡、西藏藏鸡和引进品种海赛克斯鸡TYR基因5′侧翼区及外显子1的遗传变异进行了研究。结果表明中国地方鸡品种的TYR基因蕴藏丰富的变异资源。

 

　　乌鸡因其体内丰富的黑色素沉积而具有很高的营养保健功能和重要经济性状。略阳乌鸡是中国四大乌鸡品种之一，现已成功申报国家地理标志产品，具有“六端乌”的特性，探索其黑色素形成机理为略阳乌鸡进一步品系化培育和资源保护提供了较好的理论基础，也可为乌骨鸡和禽类黑色素的形成机制研究提供一定的试验数据。本研究以略阳普通鸡和麻羽乌鸡为对照，结合GenBank公布鸡的TYR基因序列，分析了23只略阳鸡TYR基因编码区的遗传变异，分析不同SNP位点与鸡的羽色和肉色的关系。略阳普通鸡的羽色为麻色，肉色为普通色，麻羽乌鸡的羽色为杂色，肉色为黑色，略阳黑羽乌鸡所有性状均为黑色。研究发现TYR基因编码区3个突变位点在略阳乌鸡群体均有分布，但是突变位点均为同义突变，没有造成氨基酸序列的变异，不影响酪氨酸酶的蛋白质构象和功能。这一结果与前人研究结果基本符合，因为酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，一般是高度保守的，如果一些氨基酸序列的变异将影响其功能，可能导致白化病等生理现象。由于本研究的略阳鸡是正常个体，毛色都有颜色，所以TYR的氨基酸序列没有差异是正常的，说明略阳乌鸡和普通鸡的TYR基因是高度保守的，但是它们在肤色和毛色黑色素含量上的差异可能是由另外的基因造成的，也可能是由TYR基因表达量的差异引起的。本研究另外发现略阳乌鸡与普通鸡的TYR基因在启动子区和内含子区的DNA序列存在遗传差异，这些差异是否与酪氨酸酶的表达和转录剪接有关，进而影响乌鸡黑色素的沉积还有待进一步研究。

 

　　参考文献：

 

　　[1] 陕西省家畜家禽品种志编辑委员会.陕西省家畜家禽品种志[M].西安：三秦出版社，1988.

 

　　[2] 侯文通.中国西北重要地方畜禽遗传资源[M].北京：中国农业出版社，2010.

 

　　[3] 赵汉成，朱勇斌，王泉镔，等.略阳乌鸡申报国家地理标志产品保护的探讨[J].家禽科学，2008（11）：38-39.

 

　　[4] 李彩霞.略阳乌鸡保种利用现状与综合开发对策探讨[J]. 家禽科学，2010（11）：31-33.

 

　　[5] 王哲鹏，邓学梅，王安如.乌鸡黑色素对果蝇的紫外辐射保护作用[J].中国农业大学学报，2007，12（1）：17-21.

 

　　[6] 蔡华珍，吴 勇.乌鸡黑色素抗紫外线功能的应用研究[J].食品与发酵工业，2006，32（11）：47-49.

 

　　[7] SARNA T J， WIELGUS A， SKUMATZ C M，et al. Antioxidant properties of human iridial melanin[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science，2003，44（5）：1866-1870.

 

　　[8] JACOBSON E S， HOVE E， EMERY H S. Antioxidant function of melanin in Black Fungi[J]. Infection and Immunity，1995， 63（12）：4944-4945.

 

　　[9] ROZANOWSKA M， SARNA T， LAND E J，et al. Free radical scavenging properties of melanin interaction of eu-and pheo-melanin models with reducing and oxidising radicals[J]. Free Radical Biology and Medicine，1999，26（5-6）：518-525.

 

　　[10] WANG Z， DILLON J， GAILLARD E R. Antioxidant properties of melanin in retinal pigment epithelial cells[J]. Photochemistry and Photobiology，2006，82（2）：474-479.

 

　　[11] ITO S，WAKAMATSU K，OEKI H.Chemical analysis of melanins and its application to the study of the regulation of melanogenesis[J]. Pigment Cell Research，2000，13（8）：103-109.

 

　　[12] 李瑞成，尚永彪，管俊峰.乌骨鸡黑色素及其研究进展[J].肉类研究，2010， 140（10）： 54-59.

 

　　[13] JUAN C E， RAMON V， LORENA G F， et al. Kinetic characterization of the substrate specificity and mechanism of mushroom tyrosinase[J]. European Journal of Biochemistry， 2000，267（5）：1270-1278.

 

　　[14] DENOVAN-WRIRHT E M， RAMSEY N B， MCCORMICK J， et al. Nucleotide sequence of transferrin cDNA and tissue-specific.of the transferrin gene in a tlantic cod[J]. Comparative Biochemistry and Physiolog，1996，113（2）：269-273.

 

　　[15] DAVID W. Russell Joseph Sambrook Molecular Cloning， 3nd edn[M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2002.463-481.

 

　　[16] 邓学梅.用于鸡基因定位的资源群体的建立和黑色素等质量性状的遗传分析[D].北京：中国农业大学，2001.

 

　　[17] 高 东，杜 飞，朱有勇.低背景、高分辨率PAGE 简易银染法[J].遗传，2009，31（6）：668-673.

 

　　[18] KOWICHI J，DONG L，HUA C，et al. Coordinated mRNA and protein expression of human LAMP-1 in induction of melanogenesis after UV-B exposure and co-Transfection of human tyrosinase and TRP-1 cDNAs[J]. Pigment cell Res. 1994， 7（5）：311-319.

 

　　[19] JOHN C A， ALAN H K ，CHERYL A， et al. Skin-nervous system interactions[J]. Journal of Investigative Dermatology，1996，106（1）：198-204.

 

　　[20] LEVINE N. Pigmentation and Pigmentary Disorders 1st ed [M].Florida：CRC Press，1993.334-335.

 

　　[21] 杨舒黎，毛华明.酪氨酸酶基因研究进展[J].动物科学与动物医学，2003，20（9）：22-23.

 

　　[22] BOISSY R E，MOELLMANN G E，HALABAN R. Tyrosinase and acid phosphatase activities in melanocytes from avian albinos[J]. Journal of Investigative Dermatology，1987，88（3）：292-300.

 

　　[23] 陈志强，邓学梅，周 军，等.鸡的酪氨酸酶基因5′调控区的单链构象多态性分析[J]. 农业生物技术学报，2005，13（2）：191-194.

 

　　[24] 张建勤，陈 宏，孙兆军，等.不同鸡品种TYR基因遗传变异分析[J].畜牧兽医学报，2008，39（9）：1153-1158.

 

　　[25] ZHANG J Q，CHEN H，SUN Z J，et al.Flesh color association with polymorphism of the tyrosinase gene in different Chinese chicken breeds[J].Mol Biol Rep，2010，37（1）：165-169.