转NAT3基因水稻氮素利用效率分析(2)

　　NAT3基因超表达株系及对照中花11的成熟胚经消毒后，于MS培养基上获得无菌苗，选取生长状况一致的幼苗，去除胚乳后移栽到1/2MS、1/4MS、1/8MS 3个不同氮浓度的培养基上（1/2MS、1/4MS、1/8MS表示MS培养基中大量元素中的氮素减半，其余成分不变）。每个处理种植5株，40 d后取样，测定各处理5个植株的整株干重。

　　1.4 转NAT3基因水稻盆栽试验

　　盆栽基土为含氮量低的黄棕壤，碱解氮含量74.57 mg/kg。晒干后称取8 kg/（盆·干土），分别按不同氮素处理加入相应的营养元素。盆栽试验氮肥处理浓度设计如表1所示，在施用相同磷、钾肥的基础上，设4个氮素处理，分别为全氮（1N）、1/3氮（1/3N）、1/6氮（1/6N）、不施N肥（0N，空白对照），分基肥、分蘖肥和抽穗肥三期施用。NAT3基因超表达株系及对照中花11种子在育秧盘中播种，至四叶一心时选取生长一致的幼苗移栽，每盆种植4株，每个氮素处理种植6盆。抽穗期取3盆植株进行叶片叶绿素含量。成熟后另外3盆收获整个植株（包括根系），烘干后测定生物学产量和含氮量。

　　1.5 叶绿素含量测定

　　抽穗期取倒二叶片，每个处理取3个叶片，每个叶片测定2次。参考文献[12]测定叶绿素含量。

　　1.6 水稻植株含氮量及生物学产量测定

　　收获转基因株系及对照水稻整个植株（包括根系），洗净烘干后称重待测。用凯氏定氮法测定植株含氮量。

　　2 结果与分析

　　2.1 转基因株系中NAT3基因及硝酸还原酶基因OsNR1的表达

　　不同转基因株系中NAT3和OsNR1基因的转录表达情况如图1所示。10个转基因株系中有8个株系的NAT3基因有不同程度的转录表达，其中T4-1、T4-2及T4-3的NAT3基因转录量较高，而株系T4-9、T4-10及非转基因对照中花11中无NAT3基因转录。OsNR1基因在株系T4-1、T4-2及T4-3中有较高的表达量，高于在其他转基因株系与中花11中的表达量。OsNR1基因在不同转基因株系中的表达趋势与NAT3基因的表达趋势基本一致。同中花11相比，株系T4-1、T4-2及T4-3中OsNR1的转录显著增强。结果说明，NAT3基因整合到水稻基因组中后，能够正常表达，而且其超表达促进了下游硝酸还原酶OsNR1基因的表达。选择NAT3和OsNR1基因表达量高的转基因株系T4-1、T4-2及T4-3进行后续试验研究。

　　2.2 不同氮浓度培养基上NAT3基因超表达株系幼苗的生长状况

　　在不同氮浓度培养基上生长的转基因株系T4-1、T4-2、T4-3及对照中花11幼苗的干重结果如表2所示。由表2可知，在1/2MS、1/4MS、1/8MS 3种氮浓度培养基上，3个转基因株系40 d龄幼苗的干重均高于非转基因对照中花11的幼苗干重，其中在1/4MS和1/8MS培养基上转基因株系的幼苗干重与对照之间的差异达极显著水平（P<0.01）。结果表明，同对照相比，转基因水稻幼苗在低氮环境下的生长速度快于非转基因对照。

　　2.3 NAT3基因超表达水稻叶绿素含量分析

　　不同氮素营养条件下，转基因株系及非转基因对照中花11抽穗期倒二叶叶绿素含量如表3所示。由表3可知，随着氮素使用量的降低，NAT3基因超表达株系及中花11的叶片叶绿素a和叶绿素b含量均有不同程度的下降;在1/3N、1/6N及0N处理条件下，转基因株系叶绿素a含量较对照中花11高，但无显著差异（P<0.05）;T4-3在1/3N、1/6N和0N的低氮条件下的叶绿素b含量均显著（P<0.05）高于对照中花11。结果表明，在低氮环境下NAT3基因超表达株系叶绿素含量较对照有所增加，其中株系T4-3中叶绿素b含量显著高于非转基因对照。

　　2.4 NAT3基因超表达水稻植株含氮量及生物学产量

　　不同氮素营养条件下，NAT3基因超表达株系和非转基因对照中花11的含氮量和生物学产量结果如表4所示。由表4可知，转基因株系在1/3N、1/6N的条件下，其植株的生物学产量和含氮量均高于对照，其中T4-1株系在1/3N、1/6N的低氮条件下，其生物学产量和含氮量较对照的差异均达显著水平（P<0.05）;T4-3株系在1/3N、1/6N低氮条件下的生物学产量较对照的差异达极显著水平（P<0.01）。说明NAT3基因的超表达能提高水稻对氮肥的利用效率，提高植株含氮量和生物学产量。

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