一个花生新SSR标记的开发(2)

　　1.2.2 PCR产物电泳检测 SCoT-PCR与SSR-PCR产物分别使用浓度为3.5%的变性聚丙烯酰胺凝胶和6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（电泳缓冲液0.5×TBE，电压150 V，时间2 h），0.1% AgNO3染色，对电泳结果进行拍照。测序片段检测及回收使用1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用GelRed（Biotium，USA）染色，在紫外凝胶成像系统上观察并切下目标条带所在胶块放入2 mL EP管中备用。

　　1.2.3 PCR产物目的片段回收、连接载体及测序目的片段的回收、纯化使用琼脂糖凝胶回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]。将回收的目的片段与pMD19-T Vector（Simple）（TaKaRa，大连）连接后，使用热激法转化Top10感受态细胞[天根生化科技（北京）有限公司]，并进行蓝白斑筛选，挑选白色菌斑进行PCR检测，方法参考产品说明书。将检测后阳性克隆菌落接入5 mL含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜。将过夜培养菌液送金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序及菌落PCR检测均使用M13引物（引物序列见表1）。

　　1.2.4 测序结果分析测序结果经DNASTAR软件中SeqMan拼接完整，利用MegAlign比较不同供试材料间该位点的多态性，并通过NCBI BLAST进行相似性检测以及阅读框分析。

　　2 结果与分析

　　2.1 SCoT12扩增产物多态性分析

　　在8个供试品种中，SCoT12引物可扩增出11条清晰、稳定条带（图1），片段大小在300～2 000 bp之间。其中，不同品种在800 bp处均可检测到一条大小有微小差异的片段，将该片段命名为SCoT12-800。

　　2.2 SCoT12-800阳性克隆检测

　　使用M13引物对重组载体pMD19-T+SCoT12-800的转化菌株的不同单克隆进行PCR检测（图2），其中有SCoT12-800片段插入的克隆PCR扩增片段长度应为930 bp左右，而有些克隆的扩增片段长度不在上述范围，可能是pMD19-T载体在连接过程中插入了其他片段或是载体发生自连而产生了假阳性。

　　2.3 测序结果分析

　　对上述长度多态性片段的测序结果显示该扩增片段长度为808～822 bp，片段内部存在一段TC多次重复构成的SSR序列位点。图3为花生品种DF12的SCoT12-800的核苷酸序列， TC重复单元的次数为32。所选供试品种的测序结果显示该位点存在5种不同的变异类型（图4）。

　　2.4 序列比对及SSR标记引物设计

　　为了明确该SSR标记是否为已公布SSR标记，将上述测序结果进行BLAST序列比对分析。结果显示该序列是一个新发现的花生SSR序列，GenBank登录号为KM200036。根据该片段序列

　　利用Primer 5.0软件设计出一对适合SSR分子标记检测的引物，命名为SCoT12-SSR（表1）。其正向引物长度20 bp，GC含量50%，Tm值60℃；反向引物长度20 bp，GC含量55%，Tm值62℃。电泳检测结果显示该位点存在164、168、172、174、178 bp 5个等位变异（图5），电泳检测结果与测序结果吻合。

　　3 结论与讨论

　　SCoT分子标记是根据基因起始密码子（ATG）两端保守区域设计的单引物扩增片段，其扩增产物由于不同品种间启动子两端碱基变化以及碱基插入-缺失引起的变化而表现出一定的多态性[6]。此外，因为起始密码子（ATG）是功能基因的一个组成部分，所以SCoT标记技术所产生的标记很有可能与决定不同品种特性的功能基因相关联[12]。本研究对SCoT12-800片段进行阅读框分析，并未发现包含具有编码功能的阅读框，说明该标记片段与决定品种间差异特性的功能基因不关联。但由于SCoT分子标记广泛分布在整个基因组上，利用本研究方法对其他多态性标记进行序列分析，有可能检测到一些与品种特性相关的功能基因。

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