复方银杏叶颗粒改善人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的作用及其机制研究(2)

　　本实验中使用的受试药物为复方银杏叶颗粒，由银杏叶、红参、刺五加3味中药配伍而成，具有益气、活血、通络之功，用于辅助治疗心血管相关疾病。现代药理研究表明，银杏叶能增强心脑血管抗氧化功能，改善血液循环，治疗冠心病、心绞痛等心脑血管相关疾病^[6]。辅以同样具有改善心血管作用的刺五加和红参以增强药效^[7-8]。复方银杏叶颗粒三药合用，一君二臣，对其通过保护血管内皮细胞免受氧化应激损伤，并抑制细胞凋亡的药效及相关机制尚无具体文献报道。本文通过保护性给药，研究给药后各项氧化应激损伤相关生理指标变化，探讨药物的细胞保护和抗凋亡作用，为心脑血管疾病防治提供进一步的实验依据。
　　1 材料
　　XSZ-D2倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；5424R低温离心机（德国Eppendorf公司）；IC 1000自动细胞计数仪（美国Countstar公司）；ACS Calibur型流式细胞仪（美国BD公司）；spectra max plus 384连续光谱酶标仪（美国分子仪器公司）；PowerPac Basic 电泳仪（美国BIO-RAD公司）；Mini-PROTEAN Tetra System小型垂直电泳槽（美国BIO-RAD公司）；Tanon-5200全自动数码凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司）。
　　RPMI Medium 1640 basic（1×）培养基，批号8114413，美国gibco公司；胎牛血清（FBS），批号ACF73692，美国Hyclone公司；青链霉素混合液，批号 20110106，购于北京Solarbio公司；四甲基偶氮唑盐（MTT），货号M5655，美国Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO），货号 30072492，购买于中国国药公司；牛血清白蛋白（BSA），批号002014010530，美国Sigma公司；LDH（批号 20150103），SOD（批号20141016），MDA（批号20150415），NO（批号20150428）检测试剂盒，均购于南京建成公司；内皮素-1 ELISA试剂盒，批号09021101，美国Rapidbio公司；Bcl-2（批号I1212），Bax（批号F3011）抗体购买于北京中杉金桥公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，批号00061502，购于北京康为世纪公司；Caspase 3 活性检测试剂盒，货号C1115，上海碧云天公司；Super Signal West Pico化学发光底物，批号OA180111，购买于美国Thermo公司。
　　人脐静脉内皮细胞（HUVEC）由中国中医科学院中药研究所唐氏中心谷丽维老师馈赠。复方银杏叶颗粒购于江西济民可信药业有限公司；30%过氧化氢（H₂O₂，批号20131122）购买于中国国药公司。
　　2 方法
　　2.1 细胞培养
　　HUVEC培养于含有10%FBS和1%青链霉素的1640培养基中，置于37 ℃，5%CO₂的恒温培养箱中孵育，每2～3 d传代一次，取对数生长期的细胞进行实验。
　　2.2 复方银杏叶颗粒对H₂O₂诱导的氧化应激损伤的保护作用
　　根据前期实验结果，将HUVEC随机均分为6组，分别为正常对照组、模型组（1 200 μmol·L-1 H₂O₂处理）以及4个不同质量浓度的银杏叶药物干预组（80，160，320，640 mg·L^-1）。每次实验，药物处理细胞6 h，加入1 200 μmol·L^-1H₂O₂培养8 h。收集细胞或培养上清以进行后续实验。
　　2.3 复方银杏叶颗粒对内皮细胞的保护作用
　　将HUVEC按5×10³个/孔铺于96孔板中，按照2.2中方法处理后，倒置显微镜下观察内皮细胞形态学变化。每孔加入15 μL MTT（5 g·L^-1），置于培养箱中继续培养4 h，反应完全后弃去培养基，加入150 μL DMSO溶液，充分震荡10 min。使用酶标仪测定570 nm波长下吸光度A₅₇₀。根据以下公式计算出HUVEC存活率。
　　存活率=各组细胞A₅₇₀正常对照组/A₅₇₀×100%
　　2.4 LDH释放量、MDA含量、SOD活性以及NO含量测定
　　将HUVEC按2×10⁴个/孔铺于12孔板中，按照2.2中方法处理后，收集细胞培养基进行检测。以比色法测定LDH含量；以TBA法测定MDA含量；以黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量；以硝酸还原酶法测定NO含量。检测方法参照各试剂盒产品说明书。
　　2.5 内皮素-1（ET-1）含量测定

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