抗逆转基因旱稻转化体系的优化(2)

　　2.2农杆菌菌液浓度对转化的影响
　　试验结果表明，600nm处吸光度为0.1、0.2的菌液侵染后比较容易脱菌，而吸光度为0.3的菌液侵染的愈伤组织脱菌后农杆菌会再次生长（图3）。但吸光度为0.1的菌液侵染的愈伤组织在后期筛选过程中死亡率较高，菌液浓度过低会降低转化率。故本试验采用吸光度为0.2的菌液进行侵染。
　　2.3筛选剂用量的选择
　　将转化后的愈伤组织恢复5～7d后在不同筛选浓度的培养基中培养15d，统计死亡率，20、40、60mg/L草铵膦处理死亡率分别为11%、27%、60%。除草剂对愈伤组织的生长有很强的抑制作用，随着浓度的升高，抑制效果逐渐增强。当浓度为20mg/L时，愈伤组织死亡率只有11%，褐化现象不明显（图4-A）；当浓度为40mg/L时，愈伤组织明显褐化，死亡率也大幅提升。所以，为了能有效区分转化细胞和非转化细胞，降低转基因植株的假阳性率，本试验除草剂（草铵膦）浓度采用40mg/L。把转化后的愈伤组织转到含40mg/L除草剂的选择培养基上，经过15d筛选，观察发现有小部分愈伤组织全部褐化死亡；有些愈伤组织部分褐化，表面松散，虽然没有彻底死亡，但是没有长出乳白色的抗性愈伤组织；另有一部分愈伤组织虽然母体褐化，但在生长点长出抗性愈伤组织（图4-B）。对于最佳筛选剂浓度的确定，要遵循一个原则：既要抑制非转化细胞生长，又不会对转化细胞造成太大损害。本试验采用的除草剂浓度为40mg/L，低于这个浓度，大部分愈伤组织得不到控制，很难区分转化细胞和非转化细胞，造成大量假阳性；高于这个浓度，则转化细胞生长也容易被抑制，从而不容易分化。筛选过程为2轮，每轮15d，由于冀旱糯3号的抗性愈伤组织在筛选过程中生长良好，优于其他旱稻品种，无需第3轮筛选。
　　2.4预分化对分化率的影响
　　将筛选出的一部分抗性愈伤组织直接接到分化培养基上，分化率为38%，而先经过预分化再转入分化培养基的分化率为56%，后者较优，并且试验发现冀旱糯3号的分化率
　　普遍高于鲲旱1号等其他旱稻品种。
　　通过观察发现，经过预分化的愈伤组织为白色胚状颗粒，且颜色鲜亮有光泽，在分化培养基上生长较快，长势较好，未经预分化的愈伤组织颜色发黄暗淡，生长较慢，容易褐化。分化20d后观察，经过预分化的愈伤组织在分化过程中的绿点率高于未经预分化的愈伤组织，并且部分愈伤已分化出苗（图5）。可见，筛选出的抗性愈伤组织在分化之前先经过预分化处理可提高分化率。
　　由于预分化培养基中含有植物内源激素脱落酸（ABA）[11]，脱落酸是有关生长活性物质代谢的关键因子，可具有促进植物吸收营养和协调体内代谢的能力，故本试验在预分化培养基中加入ABA可有助于愈伤组织分化。
　　2.5T0代转化苗PCR反应结果
　　提取转化苗叶片DNA并进行PCR检测，由图6可见，3～21号泳道有条带，并且和作为阳性对照的质粒DNA片段大小一致，说明这20个样品中含有目的基因，可以确定是阳性植株。将扩增的目的片段进行测序，测序结果与NCBI比对，结果表明出自小立腕藓的lea-1基因已成功转化。
　　2.6数据处理结果
　　计算得：绿苗分化率41.2%，假阳性率9.1%，转化率37.5%。
　　3结论与讨论
　　冀旱糯3号为粳糯型旱稻新品种，其转化体系与普通旱稻（如鲲旱1号）有一定区别。本试验利用农杆菌转化法将目的基因导入旱稻中，建立了适用于冀旱糯3号的高效转化体系，确定了最适宜的愈伤诱导培养基为NB+2，4-D（不加脯氨酸），糖源改为麦芽糖，最佳菌液侵染浓度（以D600nm表示）为0.2，筛选培养基中除草剂最佳浓度为40mg/L，将筛选出的乳白色抗性愈伤组织经过5d预分化培养，可提高分化
　　效率。本试验提取转基因水稻基因组DNA并进行PCR检测，结果表明，利用优化后的转化体系可将转化率提高到375%。本研究结果证明目的基因已成功转入冀旱糯3号的细胞中，而目的基因的插入位点还需要进一步做tail-PCR研究。
　　【参考文献】
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　　[2]孙重霞，张桂堂，梁荣奇，等.利用转基因技术改良小麦品质的研究进展[J].分子植物育种，2009，7（2）：398-406.
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　　[11]江玲，万建民.植物激素ABA和GA调控种子休眠和萌发的研究进展[J].江苏农业学报，2007，23（4）：360-365.殷玲，吉挺，李冠华，等.中华蜜蜂OBP17基因CDS序列及其表达与抗螨性状的相关性[J].江苏农业科学，2015，43（11）：45-48.

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