２．５ＡｄＡＮＳ在‘红阳’果实发育期间的表达模式

 

　　以ＡｄＡＮＳ的５′端设计实时荧光定量ＰＣＲ，序列特异性引物如下：

 

　　Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＡＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡ

 

　　ＧＴＧＧＴＣＧＧＡＡ

 

　　ＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＧＧＧＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣ

 

　　ＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴ

 

　　猕猴桃AdＡｃｔｉｎ（ＧＩ：１４９９３８９６３）基因序列特异性引物如下：

 

　　Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＴＧＡＧＡＧＡＴＴＣＣＧＴＴ

 

　　ＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴ

 

　　Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＴＴＣＣＴＴＡＣＴＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＡＴ）

 

　　实时荧光定量ＰＣＲ结果表明（图７），AdＡＮＳ基因扩增曲线的Ｃｔ值为２２～２６，而溶解曲线呈现单峰,表明扩增的特异性好。从图８可以看出，在蒲江7０～10０ｄ，ＡｄＡＮＳ的表达量增加了9倍左右，而后表达量逐渐降低，但是花青素的净积累仍在增加，花后１1０ｄ花青素的净积累停止。花青素的净积累停止后可能又有降解发生，可能和温度及果实发育均有关。ＡｄＡＮＳ随后也保持较低的水平。而在武汉，总体来说与花青素积累量变化较小，与其相一致的是ＡｄＡＮＳ的表达水平变化也非常小（小于１．５倍）。花后110ｄ时，ＡｄＡＮＳ的表达是花后１００ｄ时的１．４倍，而后迅速下降，花后９０～１１０ｄ，ＡｄＡＮＳ的表达趋势与花青素积累增加变化趋势相一致。而１１０～１３６ｄ，花青素的积累量呈先减少再小幅增加的趋势，而ＡｄＡＮＳ的表达也与花青素的积累变化相一致，先减小后增加。结果表明，无论在何种温度状态下，花青素合成基因ＡｄＡＮＳ的表达变化都与花青素的积累变化相一致。

 

　　３小结与讨论

 

　　试验结果表明，‘红阳’猕猴桃果肉中花青素的含量在不同的季节性温度下呈现出明显的不同，尤其在季节性高温条件下，花青素的含量非常低，表明可能花青素的合成受到温度的强烈调控，尤其当蒲江在花后１０２～１０４ｄ出现了３ｄ的高温（＞３５℃）后，花青素的积累也从花后１００ｄ的最高含量５６．９μｇ／ｇ开始下降。花青素的合成尤其是花青素合成中的关键酶花青素合成酶受花青素合成途径中结构基因的直接调控［８］，研究结果也表明，在温度适宜的蒲江，花青素合成基因ＡｄＡＮＳ的表达趋势与果肉中花青素的积累规律相一致，即在花青素积累速度最快的花后９０～１００ｄ，ＡｄＡＮＳ表达水平的变化也最大。而在整个发育期间温度都较高的武汉，虽然ＡｄＡＮＳ的转录水平变化比较小，但是其表达水平的变化与花青素的积累变化规律相一致。研究结果也表明ＡｄＡＮＳ较低的表达水平可能与武汉的高温密切相关，进而导致花青素的合成下降，果实花青素的含量降低。

 

　　花青素含量是果实品质的一个重要方面，因此也是许多遗传育种工作的重点。果肉中花青素的形成是由遗传、发育和环境共同调控的复杂的代谢过程［９］。在许多果实中，当果实成熟时类黄酮途径中原本产生原花青素和黄酮醇的途径会转为花青素的合成。但是‘红阳’猕猴桃不是在果实成熟时才合成花青素，而是在果实发育中期就开始合成，一直保持到果实成熟，可能与果皮中花青素合成的机制不同。另外草莓中花青素的研究表明类黄酮的水平、相关基因的表达及酶的活性明显受到果实发育的影响［１０］。‘红阳’猕猴桃中花青素的水平除受到类黄酮相关基因的调控外，环境因子也会通过调控这些基因的转录及相关酶的活性间接影响花青素的合成。

 

　　参考文献：

 

　　［１］ＣＡＢＡＬＬＥＲＯＢ，ＴＲＵＧＯＬ，ＦＩＮＧＬＡＳＰ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆｆｏｏｄｓｃｉｅｎｃｅｓａｎｄｎｕｔｒｉｔｉｏｎ［Ｍ］．２ｎｄｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ，２００３．

 

　　［２］黄宏文．猕猴桃属分类资源驯化栽培［Ｍ］．北京：科学出版社，２０１３．

 

　　［３］ＬＩＮ－ＷＡＮＧＫ，ＭＩＣＨＥＬＥＴＴＩＤ，ＰＡＬＭＥＲＪ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒｅｄｕｃｅｓａｐｐｌｅｆｕｒｉｔｃｏｌｏｕｒｖｉａｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｏｍｐｌｅｘ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１１，３４（７）：１１７６－１１９０．

 

　　［４］ＹＡＭＡＮＥＴ，ＪＥＯＮＧＳＴ，ＧＯＴＯ－ＹＡＭＡＭＯＴＯＮ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｇｒａｐｅｂｅｒｒｙｓｋｉｎｓ［Ｊ］．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌoｆＥｎｏｌｏｇｙＡｎｄＶｉｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，２００６，５７：５４－５９．

 

　　［５］ＷＥＩＹＺ，ＨＵＦＣ，ＨＵＧＢ，ｅｔａｌ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｓｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｐｅｒｉｃａｒｐｏｆＬｉｔｃｈｉｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｏｎｎ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１１，６，ｅ１９４５５．

 

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　　［７］阮孟斌，李文彬，于晓玲，等．一种适用于多糖多酚植物的高质量ＲＮＡ快速提取方法［Ｊ］．热带作物学报，２０１１，３２（９）：１７０４－１７０７．

 

　　［８］ＭＡＲＴＥＮＳＳ，ＰＲＥＵＳＳＡ，ＭＡＴＥＲＮＵ．Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ：ｆｌａｖｏｎｏｌａｎｄａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＬ．［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，７１：１０４０－１０４９．

 

　　［９］ＪＡＡＫＯＬＡＬ．Ｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｆｒｕｉｔｓ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２０１３，18（9）：477-483．

 

　　［１０］ＣＡＲＢＯＮＥＦ，ＰＲＥＵＳＳＡ，ＤＥＶＯＳＲＣ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ，ｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｇｅｎｅｓ，ｅｎｚｙｍｅｓａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｆｒｕｉｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２００９，３２：１１１７－１１３１．