摘要：为揭示形成我国杂交稻及其骨干亲本抽穗期多样性的影响因素，研究选取杂交稻骨干亲本并用其配制了38个杂交组合，通过抽穗期田间调查，结果表明，亲本材料和F1组合的播始期表现广泛变异；通过对部分材料抽穗期控制基因Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1以及Hd3a启动子测序比较表明，仅Hd1表现出多种等位基因的变异，并且不同类型等位基因及其组合解释了抽穗期表型变异的19.75%。研究结果表明Hd1等位基因多态性是我国杂交稻骨干亲本抽穗期变异的遗传基础之一。

 

　　关键词：水稻；抽穗期；多样性；信号通路

 

　　中图分类号：S511；S336 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0508-04

 

　　水稻抽穗期是决定品种地区与季节适应性的重要农艺性状，选育早熟高产水稻品种一直为水稻育种工作者所重视。一般来讲，水稻是一种短日照植物，当日照逐渐变短时诱导营养生长向生殖生长的转换。目前对于水稻抽穗期分子遗传信号通路的研究已非常详尽，OsGI感知外界的生物钟信号和光信号后调控下游基因Heading date 1（Hd1）和OsMADS51表达。Hd1调控Heading date 3a（Hd3a）表达，Hd3a编码可移动的成花素信号，RICE FLOWERING LOCUS T1（RFT1）与Hd3a具有90%的同源序列，在功能上和Hd3a是冗余的；OsMADS51在Early heading date 1（Ehd1）上游诱导其表达，而Ehd1作为Hd3a的激活因子独立于Hd1起作用[1]。尽管水稻抽穗期信号通路已经非常清晰，但是形成水稻抽穗期多样性的分子机制还不清楚。本研究以我国杂交籼稻骨干亲本及其F1杂种为研究对象，通过自然日照条件下抽穗期的观察和重要抽穗期控制基因的测序比对，试图揭示我国杂交籼稻生育期多样性的遗传机制。

 

　　1 材料与方法

 

　　1.1 供试材料

 

　　选取具有生育期差异的长江流域杂交籼稻骨干亲本不育系和恢复系，并利用这些材料配制了38个杂交稻组合（F1），所有亲本与杂交稻组合（F1）见表1。

 

　　1.2 试验设计

 

　　F1杂交组合于2011年冬天在海南配制，亲本与F1杂种在湖北省农业科学院南湖试验站于2012年5月25日播种，6月20日移栽。每份材料单本种植3行，种植密度行距20.0 cm，株距16.7 cm。记录每份材料的抽穗期（至少有1个稻穗抽出1/2的单株数达到80%的日期），计算播始期。

 

　　1.3 试验方法

 

　　选取Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1这4个水稻中控制抽穗期的关键基因以及Hd3a的启动子，从不同亲本材料的基因组DNA扩增后送公司测序，然后进行序列比对分析。水稻抽穗期控制基因信号通路见图1A，基因结构及引物所在位置见图1B，基因扩增使用的引物序列见表2。

 

　　1.3.1 PCR扩增目的片段 PCR反应体系为20 μL， 含2.0 μL 10×Buffer，1.0 μL dNTPs（10 mmol/L），2条10 mmol/L引物各0.5 μL，0.2 μL Taq酶（5U/μL），2.0 μL模板DNA，13.8 μL ddH2O；PCR反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ 变性1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1～3 min（根据目的片段长度确定延伸时间），共35个循环；72 ℃延伸10 min。

 

　　1.3.2 PCR产物回收 使用TIANGEN公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按照说明书进行。

 

　　1.3.3 PCR产物连接 回收产物连接使用TaKaRa公司pMD18-T试剂盒，按照说明书进行。

 

　　1.3.4 连接产物转化、测序 将连接产物全量转入100 μL制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液中，冰上放置30 min；42 ℃水浴45 s，冰上放置1～2 min，加入400 μL LB培养基，37 ℃恒温摇床低速培养1 h；取200 μL涂LB平板（预先加Amp），37 ℃ 倒置培养12～16 h/d，菌落PCR检测阳性，将有目标条带扩增的菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

 

　　1.4 数据处理

 

　　所有数据均在Excel软件中进行分析和处理，序列拼接、比对用DNAMAN（软件版本：6.0.40），基因结构及氨基酸预测用MIT提供的The Genescan Web Server（http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html）。基因效应分析采用单因素方差分析，单因素（如Hd1等位基因变异）对总表型变异的贡献率R2=SSintergroup/SSoverall，其中SSintergroup为组间方差，SSoverall为总方差；F1杂种播始期超亲天数占亲本播始期比例MP1=[（F1-P1）/P1]×100%，其中F1为F1杂种播始期，P1为早抽穗亲本的播始期（计算超亲早抽穗时间）或晚抽穗亲本的播始期（计算超亲晚抽穗时间）。

 

　　2 结果与分析

 

　　2.1 亲本材料及其F1杂种的播始期

 

　　表1的结果表明，亲本材料和F1组合的播始期表现广泛变异，亲本材料播始期59～101 d，F1材料播始期60～120 d；通过计算F1杂种与两亲本播始期的相关系数，表明F1播始期与不育系的播始期没有显著的相关性，但是和恢复系播始期呈极显著正相关，相关系数为r=0.77（P<0.01），因此F1杂种播始期主要受恢复系支配。

 

　　与双亲相比，少数F1杂种播始期表现出超亲现象，6份F1杂种表现出较强的超亲晚抽穗，除杂交组合HD9802S/HR015的超亲晚抽穗天数占迟抽穗亲本播始期比例的8.4%外，其余5份杂交组合为18.8%～20.2%。7份材料表现出超亲早抽穗，超亲早抽穗天数占早抽穗亲本播始期比例的5.6%～13.0%；相同的恢复系与不同的不育系会产生超亲F1，相同的不育系与不同的恢复系也会产生超亲F1，因此F1的生育期超亲表现与双亲的组配有关。

 

　　2.2 不同材料抽穗期控制基因的序列比对

 

　　选取了16份具有不同抽穗期的水稻材料（表3），对其抽穗期控制基因Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1以及Hd3a启动子序列进行PCR扩增测序分析。除Hd1基因存在4种不同的等位基因外，其余基因均无差异。与日本晴Hd1编码区相比，4个等位基因的编码区分别表现出单核苷酸的替换、片段插入与缺失、无义突变等不同的SNP类型（图2）。利用软件预测分析，这4个等位基因分别编码4种不同的蛋白质（图3）。通过与Takahashi等[2]对水稻Hd1序列及功能分析结果的比对确定本研究中的Hd1-1和Hd1-4为有功能的等位基因，Hd1-2和Hd1-3则因为出现了大片段的缺失，表现为功能缺失型等位基因。通过计算有功能等位基因材料的播始期的平均值和功能缺失型等位基因材料的播始期的平均值可知，前者为86 d， 后者为83 d（表3），并且两者呈显著差异（P<0.05）。通过计算基因的遗传效应，表明Hd1等位基因在不同的亲本材料之间解释了抽穗期这一性状表型变异的19.75%，因此Hd1等位基因在一定程度上解释了抽穗期的表型变异，在自然日照条件下有功能的Hd1等位基因表现出抑制抽穗。

 

　　通过分析F1杂种播始期与Hd1等位基因的关系，结果表明有功能Hd1纯合型F1（HD1/HD1）的播始期平均值为89 d，杂合型（HD1/hd1）为94 d，功能缺失型Hd1的纯合型F1（hd1/hd1）的播始期平均值为83 d，并且HD1/HD1和 HD1/hd1基因型与hd1/hd1基因型的播始期均表现出显著差异（P<0.05）（表4），因此在F1杂种中有功能的Hd1相对于功能缺失型等位基因为显性，起到抑制抽穗的作用。

 

　　3 讨论

 

　　3.1 Hd1等位基因变异是长江流域杂交籼稻骨干亲本抽穗期变异的遗传基础之一

 

　　本研究选取的杂交稻骨干亲本材料中，Ehd1、Hd3a、RFT1的编码区以及Hd3a的启动子序列非常保守，没有表现出差异，Hd1的编码区表现出了4种不同等位基因类型，并且不同类型Hd1等位基因解释了自然日照条件下抽穗期19.75%的表型变异；因此，本研究结果表明Hd1等位基因多态性是我国长江流域杂交籼稻骨干亲本抽穗期变异的遗传基础之一。

 

　　3.2 关于F1杂种抽穗期的超亲现象

 

　　亲本间感光性和基本营养生长性组合的多样性及强弱的不同使得F1杂种抽穗期呈现多种多样的变化。在杂种优势利用，特别是籼粳亚种间杂种优势的利用中，常遇到超亲晚熟现象，而许多研究表明，F1杂种抽穗期是否严重超亲主要取决于双亲是否带有不同位点的互补的显性感光基因[3-5]，如果带有一对互补基因，那么F1将会表现超亲晚抽穗；徐俊锋[6]的研究结果表明F1超亲晚抽穗主要受两对显性互补感光基因E1（Hd4）和Se-1（Hd1）控制，杂种超亲晚抽穗主要由感光性引起。本研究材料中也出现了抽穗期超亲的杂交组合，其中不育系亲本814A和HD9802S与恢复系亲本HR020和HR935配组的F1超亲晚抽穗天数与晚抽穗亲本播始期的比例为18.8%～20.2%，而且不育系亲本含有有功能的Hd1等位基因，而恢复系亲本含有功能缺失型等位基因，因此存在潜在的互补基因的可能。

 

　　Chang等[7]对感光品种的感光性（PSP）和基本营养生长性（BVP）同时进行研究，认为PSP受单一显性基因或2个显性基因（Se）控制，BVP则受2个或2个以上基因（Ef）控制，这些基因具有累加效应，短的BVP相对于长的BVP为显性，因此不同Ef基因在F1材料中的互补可能会导致营养生长期比双亲的缩短，从而导致提前抽穗[8]，因此还需要进一步的试验去验证本研究中的超亲早抽穗是否也是由Ef基因导致的。

 

　　参考文献：

 

　　[1] TSUJI H， TAMAKI S， KOMIYA R， et al. Florigen and the photoperiodic control of flowering in rice[J]. Rice，2008，1（1）：25-35.

 

　　[2] TAKAHASHI Y， TESHIMA K M.， YOKOI S，et al. Variations in Hd1 proteins， Hd3a promoters， and Ehd1 expression levels contribute to diversity of flowering time in cultivated rice[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（11）：4555-4560.

 

　　[3] 董世钧，李春寿，李关土，等. 水稻籼粳杂种一代生育期的表现[J].中国水稻科学，1995，9（2）：77-81.

 

　　[4] 李和标，邹江石.水稻籼粳亚种间F1生育期超亲表现与遗传分析[J].江苏农业学报，1992，8（1）：7-12.

 

　　[5] 罗林广，翟虎渠，万建民，等.水稻抽穗期的遗传学研究[J].江苏农业学报，2001，17（2）：119-126.

 

　　[6] 徐俊锋. 水稻主要杂交稻亲本抽穗期基因型分析及籼粳交F1抽穗期超亲分析[D].南京：南京农业大学，2004.

 

　　[7] CHANG T T， LI C C， VERGARA B S. Component analysis of duration from seeding to heading in rice by the basic vegetative phase and the photoperiod-sensitive phase[J]. Euphytica，1969，18：79-91.

 

　　[8] 蔡俊迈，周元昌，李维明.杂交水稻抽穗期遗传研究Ⅱ.抽穗期基因互作的遗传[J].福建农学院学报，1988，17（1）：1-9.